Une évaluation de diverses méthodes de microscopie à super-résolution
Pour la microscopie optique conventionnelle, la diffraction de la lumière limite la résolution d'imagerie à environ 250 nm. Aujourd'hui, les techniques de super-résolution peuvent améliorer cela de plus d'un facteur 10. Cette technique est principalement réalisée grâce à trois méthodes : la microscopie de localisation d'une seule molécule, y compris la microscopie de localisation photosensible (PALM) et la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) ; microscopie à illumination structurée (SIM); et la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). Comment choisir la technologie de super-résolution est ce dont tout le monde se soucie. "Malheureusement, il n'y a pas de principes simples pour décider quelle méthode utiliser", déclare Mathew Stracy, chercheur postdoctoral à l'Université d'Oxford, au Royaume-Uni. "Chacun a ses propres avantages et inconvénients." Les scientifiques sont bien sûr également en train de déterminer comment choisir la bonne méthode pour un projet particulier. "Dans le contexte de la bioimagerie, les facteurs clés à prendre en compte incluent : la résolution spatiale et temporelle, la sensibilité aux photodommages, la capacité de marquage, l'épaisseur de l'échantillon et la fluorescence de fond ou la fluorescence autologue des cellules." Comment ça marche Les différents microscopes à super-résolution fonctionnent de différentes manières. Dans le cas de PALM et STORM, seule une petite fraction des marqueurs fluorescents est excitée ou photoactivée à un instant donné, permettant leur localisation indépendante avec une grande précision. En passant par ce processus avec toutes les étiquettes fluorescentes, on obtient une image complète en super-résolution.
Stefan Hell, l'un des lauréats du prix Nobel de chimie 2014 et directeur de l'Institut Max Planck de chimie biophysique, a déclaré : « Le système PALM/STORM est relativement facile à mettre en place, mais il est difficile à appliquer, car la technologie fluorescente groupe doit avoir une capacité de photoactivation. Limitations L'inconvénient est qu'ils doivent détecter une seule molécule fluorescente dans le contexte d'une cellule et sont moins fiables que STED. STED utilise une impulsion laser pour exciter le fluorophore et un laser en forme d'anneau pour éteindre le fluorophore, ne laissant que la fluorescence intermédiaire de taille nanométrique pour la super-résolution. La numérisation de l'ensemble de l'échantillon produit une image. "L'avantage de STED est qu'il s'agit d'une technologie à bouton-poussoir", a expliqué Hell. "Cela fonctionne comme un microscope à fluorescence confocale standard." Il peut également imager des cellules vivantes à l'aide de fluorophores tels que des protéines fluorescentes vertes ou jaunes et des colorants dérivés de la rhodamine. Comparaison paramétrique Bien que toutes les techniques de super-résolution surpassent la microscopie optique conventionnelle en termes de résolution, elles diffèrent les unes des autres. SIM double à peu près la résolution à environ 100 nm. PALM et STORM peuvent résoudre des cibles de 15 nm. Selon Hell, STED fournit une résolution spatiale de 30 nm dans les cellules vivantes et de 15 nm dans les cellules fixes. Lorsqu'il s'agit d'applications spécifiques, nous devons également tenir compte du rapport signal sur bruit.
Dans certains cas, une résolution plus faible mais un SNR plus élevé peut donner une meilleure image que l'inverse (résolution plus élevée mais SNR plus faible). La vitesse d'acquisition des images est également très importante, notamment pour les cellules vivantes. "Toutes les techniques de super-résolution sont plus lentes que les techniques d'imagerie par fluorescence conventionnelles", a déclaré Stracy. "PALM/STORM est le plus lent, il a besoin de dizaines de milliers d'images pour obtenir une seule image, SIM a besoin de dizaines d'images et STED est une technologie de numérisation, donc la vitesse d'acquisition dépend de la taille du champ de vision." En plus des cellules vivantes ou des cellules d'imagerie fixes, certains scientifiques veulent également comprendre comment les objets se déplacent. Stracy s'intéresse à la compréhension de la dynamique des systèmes biologiques dans les cellules vivantes, pas seulement des images statiques. Il combine PALM avec le suivi d'une seule particule pour analyser la dynamique des cellules vivantes. De cette façon, il peut suivre directement les molécules marqueurs pendant qu'elles remplissent leurs fonctions. Cependant, il pense que SIM n'est pas adapté à l'étude de ces processus dynamiques au niveau moléculaire, mais en raison de sa vitesse d'acquisition rapide, il est particulièrement adapté à l'observation de la dynamique de structures plus grandes, telles que des chromosomes entiers.
Les derniers résultats En 2017, l'équipe de Hell a rapporté le microscope à super-résolution MINFLUX dans Science. Selon Hell, cette méthode de super-résolution atteint pour la première fois une résolution spatiale de 1 nm. De plus, il peut suivre des molécules individuelles dans des cellules vivantes au moins 100 fois plus rapidement que d'autres méthodes. D'autres scientifiques ont également fait l'éloge du microscope MINFLUX. "De nouvelles applications et approches sont constamment développées, mais deux avancées se démarquent pour moi", a déclaré Shechtman. L'un est MINFLUX. "Il utilise une approche ingénieuse pour obtenir un positionnement moléculaire très précis." Concernant le deuxième développement passionnant, Shechtman a mentionné WE Moerner et ses collègues de l'Université de Stanford. Moerner a également reçu le prix Nobel de chimie 2014. L'un des gagnants. Pour remédier à la limitation de la résolution d'imagerie causée par la diffusion anisotrope de molécules uniques fluorescentes, les scientifiques ont utilisé différentes polarisations d'excitation pour déterminer l'orientation et la position des molécules. De plus, ils ont développé des surfaces pupillaires délicates. Ces techniques améliorent la capacité de localisation des structures. À propos des étiquettes fluorescentes Dans de nombreuses applications de super-résolution, les étiquettes sont vraiment importantes. Certaines entreprises proposent également des produits connexes.
Par exemple, l'Allemand Miltenyi s'est associé à Abberior, une société fondée par Stefan Hell, pour fournir des services de conjugaison d'anticorps personnalisés pour les colorants de microscopie à super résolution. Un certain nombre d'autres sociétés proposent également des marqueurs assortis. "Nos Nano-Boosters sont très petits, seulement 1,5 kDa, et très spécifiques", explique Christoph Eckert, responsable marketing chez ChromoTek. Ces protéines se lient aux protéines fluorescentes vertes et rouges (GFP et RFP). Ils sont dérivés de fragments d'anticorps d'alpaga, appelés VHH ou nanobodies, avec d'excellentes propriétés de liaison et une qualité stable sans variation d'un lot à l'autre. Ces marqueurs conviennent à diverses techniques de super-résolution, notamment SIM, PALM, STORM et STED. Ai-Hui Tang, professeur adjoint à la faculté de médecine de l'Université du Maryland, et ses collègues ont utilisé le GFP-Booster et STORM de ChromoTek pour explorer la propagation de l'information dans le système nerveux. Ils ont trouvé des nanoclusters moléculaires, appelés nanocolonnes, dans les neurones présynaptiques et postsynaptiques. Les scientifiques pensent que cette structure montre que le système nerveux central utilise des principes simples pour maintenir et réguler l'efficacité synaptique. Diverses versions de l'imagerie à super-résolution et un nombre croissant de méthodes entraînent les scientifiques encore plus profondément dans les mystères biologiques. En cassant la limite de diffraction de la lumière visible, les biologistes peuvent même "surveiller de près" les actions des cellules.
