Structure de base de la microscopie confocale à fluorescence
(1) Module de numérisation
Le module de numérisation se compose principalement d'une barre lumineuse à sténopé (contrôleant l'épaisseur des tranches optiques), d'un spectroscope (changeant la direction de propagation de la lumière en fonction de la longueur d'onde), d'un colorimètre à fluorescence d'émission (sélectionnant la lumière dans une certaine plage de longueurs d'onde pour la détection) et un détecteur (tube photomultiplicateur). La fluorescence mixte dans l'échantillon fluorescent entre dans le scanner et, après avoir été sélectionnée par la barre lumineuse à sténopé de détection, le spectromètre et le colorimètre, elle est divisée en diverses fluorescences monochromatiques, qui sont détectées dans différents canaux de fluorescence et forment des images confocales correspondantes. En même temps, plusieurs images de fluorescence monochromatiques parallèles et leurs images composites peuvent être affichées sur l'écran de l'ordinateur.
(2) Système de microscopie à fluorescence
Le microscope est le composant principal du LSCM, qui est lié à la qualité d'imagerie du système. Le chemin optique du microscope peut être facilement inséré dans un système optique infiniment éloigné doté d'options optiques sans affecter la qualité de l'imagerie et la précision des mesures. L’objectif doit être un objectif apochromatique à champ plat à grande ouverture numérique, bénéfique pour l’acquisition de fluorescence et l’imagerie claire. La conversion du groupe d'objectifs, la sélection du groupe de filtres de couleur, le réglage du mouvement de la scène et le verrouillage de la mémoire du plan focal doivent tous être automatiquement contrôlés par l'ordinateur.
Le microscope à fluorescence utilisé en microscopie confocale à balayage laser est généralement le même qu'un microscope à fluorescence classique, mais il a ses propres caractéristiques : il doit être connecté à un scanner, afin que le laser puisse entrer dans l'objectif du microscope pour irradier l'échantillon et faire la fluorescence émise par l'échantillon atteint le détecteur ; Un dispositif de conversion du chemin lumineux est nécessaire, qui convertit les lampes au mercure en lasers, et l'intensité lumineuse de la lampe au mercure peut être ajustée.
(3) Lasers courants
Les sources laser utilisées en microscopie confocale à balayage laser comprennent des systèmes monolaser et multilaser, et les lasers couramment utilisés comprennent les trois types suivants :
Laser à semi-conducteur : 405 nm (ligne spectrale proche ultraviolette)
Laser à ions argon : 457 nm, 477 nm, 488 nm, 514 nm (lumière bleue-verte)
Laser He-Ne : 543 nm (laser vert He-Ne à lumière verte) 633 nm (laser rouge He-Ne à lumière rouge)
Laser UV (laser UV) : 351 nm, 364 nm (lumière UV)
(4) Équipements auxiliaires
Systèmes de refroidissement refroidis par air et par eau et alimentations régulées.
Le principe de fonctionnement de base d'un microscope confocal à balayage laser consiste d'abord à émettre une certaine longueur d'onde de lumière d'excitation à partir du laser. Après amplification, la lumière traverse la barre lumineuse à sténopé éclairée dans le scanner pour former une source lumineuse ponctuelle. L'objectif se concentre sur le plan focal de l'échantillon et les points éclairés correspondants sur l'échantillon sont excités et émettent une fluorescence. Après avoir traversé la barre lumineuse du trou de détection, il atteint le détecteur et est visualisé sur l'écran de surveillance de l'ordinateur. De cette manière, une image confocale complète est formée par les images de fluorescence de chaque point de l'échantillon sur le plan focal, appelée tranche de lumière.
