Comparaison entre le microscope confocal et le microscope optique ordinaire
Microscope optique général
Le microscope biologique général se compose de trois parties, à savoir : ① système d'éclairage, comprenant la source de lumière et le condenseur ; ② Le système d'amplification optique, composé d'un objectif et d'un oculaire, constitue le corps principal du microscope. Afin d'éliminer l'aberration sphérique et l'aberration chromatique, l'oculaire et l'objectif sont composés de groupes de lentilles complexes ; (3) dispositif mécanique, utilisé pour fixer les matériaux et pour une observation pratique.
Le fait que l'image du microscope soit claire ou non dépend non seulement du grossissement, mais aussi de la résolution du microscope. La résolution fait référence à la capacité du microscope (ou de l'endroit où les yeux humains sont à 25 cm de la cible) à distinguer le petit intervalle de l'objet zui. La résolution dépend de la longueur d'onde de la lumière, du rapport d'ouverture et de l'indice de réfraction du milieu, qui s'exprime par la formule :
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎpéché /2
Où : n= indice de réfraction du milieu ;=angle du miroir (l'angle d'ouverture de l'échantillon par rapport à l'ouverture de l'objectif) et NA= ouverture numérique. L'angle du miroir est toujours inférieur à 180 ? Par conséquent, la valeur zui de sina/2 doit être inférieure à 1.
L'indice de réfraction du verre utilisé pour fabriquer des lentilles optiques est de 1,65 à 1,78, et l'indice de réfraction du milieu utilisé est plus proche de celui du verre, mieux c'est. Pour l'objectif sec, le milieu est l'air et le rapport d'ouverture est généralement de 0.05 ~ 0,95 ; La lentille à huile utilise de l'asphalte parfumé comme support et le taux d'ouverture de la lentille peut être proche de 1,5.
La longueur d'onde de la lumière ordinaire est de 400~700 nm, donc la résolution du microscope n'est pas inférieure à 0,2 μm et la résolution de l'œil humain est de 0,2 mm, donc le grand grossissement de zui conçu par le microscope général est généralement de 1000X x.
Pourquoi avez-vous besoin d'un microscope confocal ?
1. Le microscope optique a été perfectionné grâce aux efforts et aux améliorations de nos grands prédécesseurs. En fait, les microscopes ordinaires peuvent nous fournir de belles images microscopiques simplement et rapidement. Cependant, un événement qui a apporté une innovation révolutionnaire dans ce monde de microscope presque parfait s'est produit, à savoir l'invention du « microscope confocal à balayage laser ». Ce nouveau microscope se caractérise par l'adoption d'un système optique qui extrait uniquement les informations de l'image sur le plan où la mise au point est concentrée, et par la restauration des informations obtenues dans la mémoire d'image tout en changeant la mise au point, de sorte qu'une image vive avec des informations tridimensionnelles complètes peut être obtenu. Grâce à cette méthode, des informations sur la forme de la surface qui ne peuvent pas être confirmées par des microscopes ordinaires peuvent être simplement obtenues. De plus, pour les microscopes optiques ordinaires, « améliorer la résolution » et « approfondir la profondeur de focalisation » sont des conditions contradictoires, notamment à fort grossissement, mais pour les microscopes confocaux, ce problème est résolu.
2. Avantages du système optique confocal
Le système optique confocal éclaire le point d'échantillonnage et la lumière réfléchie est également reçue par des récepteurs ponctuels. Lorsque l'échantillon est placé dans la position focale, presque toute la lumière réfléchie peut atteindre le photorécepteur, mais lorsque l'échantillon s'écarte du foyer, la lumière réfléchie ne peut pas atteindre le photorécepteur. C'est-à-dire que dans le système optique confocal, seule l'image qui coïncide avec la mise au point sera émise, et la facula et la lumière diffusée inutile seront protégées.
3. Pourquoi utiliser un laser ?
Dans le système optique confocal, l'échantillon est éclairé et la lumière réfléchie est également reçue par un photorécepteur ponctuel. Une source lumineuse ponctuelle devient donc nécessaire. Le laser appartient à une source de lumière très ponctuelle. Dans la plupart des cas, la source lumineuse du microscope confocal adopte une source de lumière laser. De plus, les caractéristiques du laser, telles que la monochromaticité, la directivité et l’excellente forme du faisceau, sont également des raisons importantes pour sa large utilisation.
4. L'observation en temps réel basée sur un balayage à grande vitesse devient possible.
Dans le balayage laser, le déflecteur optique acoustique (élément principal AO) est utilisé dans la direction horizontale et le miroir servo galvano est utilisé dans la direction verticale. Parce qu'il n'y a pas de partie de vibration mécanique dans l'unité de déviation optique acoustique, elle peut balayer à grande vitesse et il est possible d'observer en temps réel sur l'écran de surveillance. La vitesse élevée de cette caméra est un projet très important qui affecte directement la vitesse de mise au point et de récupération de position.
5. Relation entre la position de mise au point et la luminosité
Dans le système optique confocal, lorsque l'échantillon est correctement placé dans la position de mise au point, la luminosité est grande, et avant et après, sa luminosité chutera fortement (ligne continue sur la figure 4). Cette sélectivité sensible du plan focal est également le principe de mesure de la direction de la hauteur du microscope confocal et de l'expansion de la profondeur focale. En revanche, le microscope optique ordinaire ne présente pas de changement évident de luminosité avant et après la position de mise au point (ligne pointillée sur la figure 4).
6. Contraste élevé et haute résolution
Dans un microscope optique général, la lumière réfléchie s'écartant de la mise au point interférera et chevauchera la partie d'imagerie de la mise au point, réduisant ainsi le contraste de l'image. En revanche, dans le système optique confocal, la lumière diffusée à l'extérieur du foyer et la lumière diffusée à l'intérieur de l'objectif sont presque complètement supprimées, ce qui permet d'obtenir une image avec un contraste très élevé. De plus, comme la lumière traverse deux fois l'objectif, l'image ponctuelle est d'abord accentuée et la résolution du microscope est également améliorée.
7. Fonction de localisation optique
Dans le système optique confocal, la lumière réfléchie de la partie autre que le point focal est protégée par des micropores. Par conséquent, lors de l’observation d’un échantillon tridimensionnel, une image similaire à celle formée après avoir découpé l’échantillon avec la mise au point est formée (Figure 5). Cet effet est appelé localisation optique, qui appartient à l'une des spécialités du système optique confocal.
8. Fonction de mémoire mobile de mise au point
La lumière dite réfléchie en dehors du foyer est protégée par les micropores. En revanche, on peut considérer que tous les points de l'image formée par le système optique confocal coïncident avec le foyer. Par conséquent, si l'échantillon tridimensionnel est déplacé le long de la direction de l'axe Z (axe optique), l'image sera accumulée et stockée dans la mémoire, et zui obtiendra finalement l'image formée par la coïncidence de l'échantillon entier et du foyer. . De cette manière, la fonction de profondeur de champ infinie est appelée fonction de mémoire mobile.
9. Fonction de mesure de la forme de la Surface
Dans la fonction de déplacement de mise au point, la forme de la surface de l'échantillon peut être mesurée sans contact en ajoutant une boucle d'enregistrement de hauteur. Sur la base de cette fonction, il est possible d'enregistrer les coordonnées de l'axe Z formées par la grande valeur de luminosité de zui dans chaque pixel, et sur la base de ces informations, les informations liées à la forme de la surface de l'échantillon peuvent être obtenues.
10. Fonction de mesure de micro-taille de haute précision
L'unité de réception de lumière adopte un capteur d'imagerie CCD unidimensionnel, de sorte qu'elle ne peut pas être affectée par l'inclinaison de balayage du dispositif de balayage, de sorte qu'une mesure de haute précision puisse être effectuée. De plus, étant donné que la fonction de mémoire de déplacement de mise au point avec profondeur de mise au point réglable est adoptée en même temps, l'erreur de mesure provoquée par le décalage de mise au point peut être éliminée.
11. Analyse d'images tridimensionnelles
Grâce à la fonction de mesure de la forme de la surface, l'image tridimensionnelle de la surface de l'échantillon peut être facilement réalisée. Non seulement cela, mais de nombreux types d'analyses peuvent également être effectués, tels que : mesure de la rugosité de la surface, surface, volume, surface, circularité, rayon, longueur du zui, périmètre, centre de gravité, image tomographique, transformation FFT, ligne. mesure de la largeur et ainsi de suite.
Le microscope confocal à balayage laser peut être utilisé non seulement pour observer la morphologie cellulaire, mais également pour l'analyse quantitative des composants biochimiques des cellules, les statistiques de densité optique et la mesure de la morphologie cellulaire.
