Détermination du nombre de micro-organismes - la méthode de comptage direct du microscope !
La croissance de la population bactérienne se manifeste par une augmentation du nombre de cellules ou une augmentation de la masse cellulaire. Les procédés de détermination du nombre de cellules comprennent un procédé de comptage direct au microscope, un procédé de comptage de colonies sur plaque, un procédé de rapport d'huile photoélectrique, un procédé de probabilité maximale et un procédé de filtration sur membrane. Les méthodes de mesure de la matière cellulaire comprennent la détermination du poids sec des cellules, la détermination de certains composants cellulaires tels que la teneur en azote, en ARN et en ADN, et la détermination des métabolites. En bref, il existe de nombreuses méthodes pour mesurer la croissance des micro-organismes, chacune avec ses propres avantages et inconvénients, et doit être sélectionnée en fonction de la situation spécifique. Cette expérience présente principalement la méthode de comptage direct au microscope couramment utilisée dans la production et la recherche scientifique.
1. Exigences relatives à l'objectif
1. Clarifier le principe de la numération globulaire.
2. Maîtriser la méthode de comptage des micro-organismes à l'aide d'un compteur de cellules sanguines.
2. Principes de base
La méthode de comptage direct au microscope est une méthode simple, rapide et intuitive pour compter directement une petite quantité de suspension de l'échantillon à tester sur une lame de verre spéciale d'une certaine surface et d'un certain volume (également appelée compteur de bactéries). Méthodes. À l'heure actuelle, les compteurs de bactéries couramment utilisés au pays et à l'étranger sont : le tableau de comptage des cellules sanguines, le compteur de bactéries Peteroff-Hauser et le compteur de bactéries Hawksley, etc. Ils peuvent être utilisés pour le comptage des levures, des bactéries, des spores de moisissures et d'autres suspensions, et le principe de base est le même. Les deux derniers types de compteurs de bactéries ont un volume total de 0.02 mm3 après avoir été recouverts d'un verre de protection, et la distance entre le verre de protection et la lame n'est que de 0,02 mm, de sorte que l'huile L'objectif à immersion peut être utilisé pour observer et observer de petites cellules telles que des bactéries. compter. Outre ces bactériomètres, il existe également une méthode d'estimation du rapport de la surface du frottis à la surface du champ visuel observé directement au microscope, qui est généralement utilisée pour l'examen bactériologique du lait. Les avantages de la méthode de comptage direct au microscope sont intuitifs, rapides et faciles à utiliser. Cependant, l'inconvénient de cette méthode est que le résultat mesuré est généralement la somme des cellules mortes et vivantes. À l'heure actuelle, il existe certaines méthodes pour surmonter cette lacune, telles que la combinaison de bactéries viables colorant la culture en microchambre (courte durée) et l'ajout d'inhibiteurs de la division cellulaire pour atteindre l'objectif de ne compter que les bactéries viables.
Dans cette expérience, un hémocytomètre a été utilisé comme exemple pour le comptage microscopique direct. Pour l'utilisation des deux autres types de compteurs de bactéries, veuillez vous référer aux instructions de chaque fabricant. Le comptage directement sous le microscope avec un hémocytomètre est une méthode couramment utilisée pour compter les micro-organismes. La plaque de comptage est une lame de verre spéciale, sur laquelle trois plates-formes sont formées par quatre fentes ; la plate-forme plus large au milieu est divisée en deux moitiés par une courte fente transversale, et il y a une grille de chaque côté de la plate-forme. Chaque grille est divisée en neuf grands carrés, et le grand carré du milieu est la salle de comptage. La structure de la plaque de numération des cellules sanguines est illustrée à la figure l{{{{10}}}}. L'échelle de la salle de comptage a généralement deux spécifications, l'une est un grand carré divisé en 25 carrés du milieu, et chaque carré du milieu est divisé en 16 petits carrés (Figure 15-2) ; l'autre est un grand carré. Le carré est divisé en 16 carrés du milieu et chaque carré du milieu est divisé en 25 petits carrés, mais quel que soit le type de tableau de comptage, il y a 400 petits carrés dans chaque grand carré. La longueur du côté de chaque grand carré est de 1 mm et la surface de chaque grand carré est de 1 mm2. Après avoir recouvert d'une lamelle couvre-objet, la hauteur entre la lamelle couvre-objet et la lamelle est de 0,1 mm, le volume de la chambre de comptage est donc de 0,1 mm3 (un millième de millilitre). Figure 15-1 La structure du tableau de comptage des cellules sanguines (1) Figure 15-2 La structure du tableau de comptage des cellules sanguines (2) A. Vue de face ; B. Vue en coupe longitudinale ; La grille agrandie, le grand carré au milieu est la chambre de comptage 1. Plaque de comptage des cellules sanguines ; 2. Verre de couverture ; 3. Lors du comptage dans la chambre de comptage, comptez généralement le nombre total de bactéries dans cinq carrés, puis calculez la moyenne de chaque carré et multipliez par 25 ou 16 pour obtenir Le nombre total de bactéries dans un grand carré est ensuite converti en nombre total de bactéries dans 1 ml de solution bactérienne. Supposons que le nombre total de bactéries dans les cinq carrés soit A et que le taux de dilution de la solution bactérienne soit B. S'il s'agit d'une plaque de comptage avec 25 carrés, le nombre total de bactéries dans 1 mL de solution bactérienne {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(morceaux) De même, s'il s'agit d'une plaque de comptage avec 16 carrés moyens, le nombre total de bactéries dans 1 mL de solution bactérienne=A/ 5×16×104×B=32000A·B (pièces)
3. Équipement
1. Bactéries
Saccharomyces cerevisiae
2. Instruments ou autres ustensiles
Hémocytomètre, microscope, lamelle, compte-gouttes capillaire stérile.
4. Étapes de fonctionnement
1. Préparation de la suspension bactérienne
Saccharomyces cerevisiae a été préparé dans une suspension bactérienne de concentration appropriée avec du sérum physiologique stérile.
2. Salle de comptage au microscope
Avant d'ajouter des échantillons, inspectez au microscope la chambre de comptage de la plaque de comptage. S'il y a de la saleté, il doit être nettoyé et séché avant le comptage.
3. Ajouter un échantillon
Couvrir l'hémocytomètre propre et sec avec une lamelle, puis utiliser un compte-gouttes capillaire stérile pour déposer une petite goutte de la suspension secouée de Saccharomyces cerevisiae du bord de la lamelle, et laisser la solution bactérienne se déplacer automatiquement le long de l'écart par osmose capillaire. En entrant dans la salle de comptage, la salle de comptage générale peut être remplie de liquide bactérien. Lors de l'échantillonnage, agitez d'abord la solution bactérienne ; lors de l'ajout d'échantillons, aucune bulle d'air ne doit être générée dans la chambre de comptage.
4. Comptage au microscope
Après avoir ajouté l'échantillon, restez immobile pendant 5 minutes, puis placez l'hémocytomètre sur la platine du microscope, trouvez d'abord l'emplacement de la chambre de comptage avec un microscope à faible puissance, puis passez à un microscope à haute puissance pour le comptage. Réglez l'intensité de la lumière du microscope de manière appropriée. Pour les microscopes qui utilisent des miroirs pour l'éclairage, veillez à ne pas dévier d'un côté de la lumière, sinon il ne sera pas facile de voir clairement les lignes carrées de la salle de comptage dans le champ de vision, ou seules des lignes verticales ou des lignes horizontales seront être vu. S'il s'avère que la solution bactérienne est trop concentrée ou trop diluée avant comptage, il est nécessaire de réajuster la dilution avant comptage. Généralement, la dilution de l'échantillon nécessite environ 5 à 10 bactéries dans chaque petite cellule. Chaque chambre de comptage sélectionne 5 cellules du milieu (4 coins en option et une cellule du milieu au centre) pour le comptage. Les cellules situées sur la ligne de grille ne sont généralement comptées que sur les lignes supérieure et droite. Dans le cas du bourgeonnement des levures, lorsque la taille du bourgeon atteint la moitié de la cellule mère, il est compté comme deux cellules bactériennes. Pour compter un échantillon, calculez le contenu bactérien de l'échantillon en calculant la valeur moyenne des deux chambres de comptage.
5. Laver le nombre de cellules sanguines
Après utilisation, rincez la carte de numération des cellules sanguines avec de l'eau dans le robinet, ne frottez pas avec des objets durs et séchez-la vous-même ou avec un sèche-cheveux après le lavage. Examen microscopique pour observer s'il y a des bactéries résiduelles ou d'autres sédiments dans chaque petite cellule. S'il n'est pas propre, il doit être lavé plusieurs fois jusqu'à ce qu'il soit propre.
