Différence entre un microscope à fluorescence et un microscope normal
J'ai récemment essayé de réaliser des coupes congelées de souris. Ensuite, j'utiliserai un microscope à fluorescence pour voir si le virus que j'ai injecté se trouve dans la zone cérébrale souhaitée. Certains principes de base de la microscopie à fluorescence doivent être appris brièvement et je les partagerai ici.
Les microscopes à fluorescence utilisent la lumière ultraviolette comme source de lumière pour éclairer l'objet inspecté, ce qui amène l'objet à émettre de la lumière, puis à observer l'objet au microscope. Il est principalement utilisé pour les cellules d’immunofluorescence. Il est principalement composé d'une source lumineuse, d'un système de plaques filtrantes et d'un système optique. L'image fluorescente de l'échantillon est observée grâce au grossissement de l'oculaire et de l'objectif. Jetons un coup d'œil à la différence entre un microscope à fluorescence et un microscope optique ordinaire.
1. Regardez la méthode d'éclairage
La méthode d'éclairage du microscope à fluorescence est généralement l'épi-illumination, ce qui signifie que la source de lumière est placée sur l'échantillon à tester à travers l'objectif.
2. Regardez la résolution
Les microscopes à fluorescence utilisent la lumière ultraviolette comme source de lumière, qui a une longueur d'onde plus courte mais une résolution plus élevée que les microscopes optiques ordinaires.
3. Différences de filtres
Les microscopes à fluorescence utilisent deux filtres spéciaux, l'un utilisé devant la source de lumière pour filtrer la lumière visible et l'autre entre l'objectif et l'oculaire pour filtrer les rayons ultraviolets, ce qui peut protéger les yeux humains.
Le microscope à fluorescence est également un type de microscope optique. La raison principale est que la longueur d'onde excitée par le microscope à fluorescence est courte, ce qui entraîne une différence de structure et d'utilisation entre le microscope à fluorescence et le microscope ordinaire. La plupart des microscopes à fluorescence ont une bonne fonction de capture de lumière faible. , sa capacité d'imagerie est donc également bonne sous une fluorescence extrêmement faible. Couplé à l'amélioration continue des microscopes à fluorescence ces dernières années, le bruit a également été considérablement réduit. C’est pourquoi de plus en plus de microscopes à fluorescence sont utilisés.
Connaissance de la microscopie à fluorescence biphotonique
Le principe de base de l'excitation à deux photons est le suivant : dans des conditions de densité photonique élevée, les molécules fluorescentes peuvent absorber deux photons de grande longueur d'onde en même temps et, après une courte durée de vie dite de l'état excité, émettre un photon avec une longueur d'onde plus courte. . ;L'effet est le même que celui de l'utilisation d'un photon avec une longueur d'onde moitié inférieure à la longueur d'onde longue pour exciter des molécules fluorescentes. L'excitation à deux photons nécessite une densité photonique élevée. Afin de ne pas endommager les cellules, les microscopes à deux photons utilisent des lasers à impulsions à mode verrouillé de haute énergie. Ce laser émet une lumière laser avec une énergie maximale élevée et une énergie moyenne faible, avec une largeur d'impulsion de seulement 100 femtosecondes et une fréquence de 80 à 100 MHz. Lorsque vous utilisez un objectif à haute ouverture numérique pour focaliser les photons du laser pulsé, la densité de photons au foyer de l'objectif est la plus élevée. L'excitation à deux photons ne se produit qu'au foyer de l'objectif, de sorte que le microscope à deux photons ne nécessite pas de sténopé confocal, ce qui améliore l'efficacité de la détection de fluorescence.
Dans le phénomène général de fluorescence, en raison de la faible densité de photons de la lumière d'excitation, une molécule fluorescente ne peut absorber qu'un seul photon à la fois puis émettre un photon de fluorescence via une transition radiative. Il s’agit de la fluorescence monophotonique. Pour le processus d'excitation de fluorescence utilisant le laser comme source de lumière, des phénomènes de fluorescence à deux photons, voire multiphotons, peuvent se produire. Dans ce cas, l'intensité de la source lumineuse d'excitation utilisée est élevée et la densité de photons répond à l'exigence selon laquelle les molécules fluorescentes absorbent deux photons en même temps. Lors de l'utilisation de lasers ordinaires comme sources de lumière d'excitation, la densité de photons n'est toujours pas suffisante pour produire une absorption à deux photons. Des lasers à impulsions femtosecondes sont généralement utilisés et leur puissance instantanée peut atteindre le niveau du mégawatt. Par conséquent, la longueur d’onde de la fluorescence à deux photons est plus courte que la longueur d’onde de la lumière d’excitation, ce qui équivaut à l’effet produit par une excitation à demi-longueur d’onde d’excitation.
