Différence entre le microscope à fluorescence et le microscope normal
1. Regardez la méthode d'éclairage
La méthode d'éclairage du microscope à fluorescence est généralement de type épi, c'est-à-dire que la source lumineuse est placée sur l'échantillon à tester à travers l'objectif.
2. Regardez la résolution
Les microscopes à fluorescence utilisent la lumière ultraviolette comme source de lumière, avec une longueur d'onde relativement courte, mais la résolution est supérieure à celle des microscopes optiques ordinaires.
3, la différence dans le filtre
Le microscope à fluorescence utilise deux filtres spéciaux, utilisés devant la source lumineuse pour filtrer la lumière visible, et utilisés entre l'objectif et l'oculaire pour filtrer la lumière ultraviolette, qui peut protéger les yeux humains.
Le microscope à fluorescence est également un type de microscope optique, principalement parce que la longueur d'onde excitée par le microscope à fluorescence est courte, ce qui conduit à la différence de structure et d'utilisation du microscope à fluorescence et du microscope ordinaire. La plupart des microscopes à fluorescence ont une bonne fonction de capture de lumière faible. , donc sous une fluorescence extrêmement faible, sa capacité d'imagerie est également bonne. Couplé à l'amélioration continue de la microscopie à fluorescence ces dernières années, le bruit a également été fortement réduit. Par conséquent, de plus en plus de microscopes à fluorescence sont utilisés.
Connaissance de la microscopie à fluorescence à deux photons
Le principe de base de l'excitation à deux photons est le suivant : dans le cas d'une forte densité de photons, les molécules fluorescentes peuvent absorber deux photons de grande longueur d'onde en même temps, et après une très courte durée de vie dite à l'état excité, émettre un photon de courte longueur d'onde ; l'effet est le même que l'utilisation d'un photon avec une longueur d'onde la moitié de la longueur d'onde longue pour exciter une molécule fluorescente. L'excitation à deux photons nécessite une densité de photons élevée et, afin de ne pas endommager les cellules, la microscopie à deux photons utilise des lasers pulsés à verrouillage de mode à haute énergie. Ce laser émet une lumière laser avec une énergie de crête élevée et une énergie moyenne faible, avec une largeur d'impulsion de seulement 100 femtosecondes et une fréquence de 80 à 100 MHz. Lorsqu'une lentille d'objectif à grande ouverture numérique est utilisée pour focaliser les photons du laser pulsé, la densité de photons au point focal de la lentille d'objectif est la plus élevée et l'excitation à deux photons se produit uniquement au point focal de la lentille d'objectif, Ainsi, le microscope à deux photons n'a pas besoin d'un trou d'épingle confocal, ce qui améliore l'efficacité de détection de fluorescence.
Dans le phénomène général de fluorescence, en raison de la faible densité de photons de la lumière d'excitation, une molécule fluorescente ne peut absorber qu'un seul photon à la fois, puis émettre un photon fluorescent à travers la transition de rayonnement, appelée fluorescence à photon unique. Pour le processus d'excitation de fluorescence avec un laser comme source de lumière, un phénomène de fluorescence à deux photons ou même à plusieurs photons peut se produire. A ce moment, l'intensité de la source de lumière d'excitation utilisée est élevée et la densité de photons répond à l'exigence selon laquelle la molécule fluorescente absorbe deux photons en même temps. Dans le processus d'utilisation d'un laser général comme source de lumière d'excitation, la densité de photons n'est toujours pas suffisante pour produire une absorption à deux photons. Habituellement, un laser pulsé femtoseconde est utilisé, et sa puissance instantanée peut atteindre l'ordre du mégawatt. Par conséquent, la longueur d'onde de la fluorescence à deux photons est plus courte que la longueur d'onde de la lumière d'excitation, ce qui équivaut à l'effet produit par l'excitation à demi-longueur d'onde d'excitation.
La microscopie à fluorescence à deux photons présente de nombreux avantages :
1) La lumière à grande longueur d'onde est moins affectée par la diffusion que la lumière à courte longueur d'onde et peut facilement pénétrer l'échantillon ;
2) Les molécules fluorescentes à l'extérieur du plan focal ne sont pas excitées, de sorte que plus de lumière d'excitation peut atteindre le plan focal, de sorte que la lumière d'excitation puisse pénétrer des spécimens plus profonds ;
3) La lumière proche infrarouge à grande longueur d'onde est moins toxique pour les cellules que la lumière à courte longueur d'onde;
4) Lors de la visualisation d'échantillons au microscope à deux photons, le photoblanchiment et la phototoxicité ne sont présents qu'au niveau du plan focal. Par conséquent, la microscopie à deux photons est plus appropriée pour visualiser des échantillons épais que la microscopie à photon unique, pour visualiser des cellules vivantes ou pour effectuer des expériences de photoblanchiment à point fixe.
Connaissance de la microscopie confocale à fluorescence
Le principe de base de la microscopie confocale à fluorescence : en utilisant une source lumineuse ponctuelle pour éclairer l'échantillon, une petite tache lumineuse au contour bien défini se forme sur le plan focal. constitué du séparateur de faisceau. Le séparateur de faisceau envoie la fluorescence directement au détecteur. Il y a un trou d'épingle devant la source lumineuse et le détecteur, respectivement appelé trou d'épingle d'éclairage et trou d'épingle de détection. Les dimensions géométriques des deux sont les mêmes, environ 100-200 nm ; par rapport à la tache lumineuse sur le plan focal, les deux sont conjugués, c'est-à-dire que la tache lumineuse traverse une série de lentilles et peut finalement être focalisée sur le sténopé d'éclairage et le sténopé de détection en même temps. De cette manière, la lumière provenant du plan focal peut être concentrée dans la plage du trou de détection, tandis que la lumière diffusée au-dessus ou au-dessous du plan focal est bloquée hors du trou de détection et ne peut pas être imagée. L'échantillon est balayé point par point avec le laser, et le tube photomultiplicateur après détection du sténopé obtient également l'image confocale de la lumière correspondante point par point, qui est convertie en un signal numérique et transmise à l'ordinateur, et enfin agrégée sur l'écran en une image confocale claire de tout le plan focal. .
Chaque image du plan focal est en fait une coupe optique de l'échantillon, et cette coupe optique a toujours une certaine épaisseur, également appelée tranche optique. Étant donné que l'intensité lumineuse au point focal est bien supérieure à celle du point non focal et que la lumière du plan non focal est filtrée par le trou d'épingle, la profondeur de champ du système confocal est approximativement nulle et le balayage le long du L'axe Z peut réaliser une tomographie optique, formant l'Observer une section optique bidimensionnelle au point focalisé de l'échantillon. En combinant le balayage du plan XY (plan focal) avec le balayage de l'axe Z (axe optique), en accumulant des images bidimensionnelles de couches successives et en les traitant par un logiciel informatique spécial, une image tridimensionnelle de l'échantillon peut être obtenue.
C'est-à-dire que le trou d'épingle de détection et le trou d'épingle de source lumineuse sont toujours focalisés sur le même point, de sorte que la fluorescence excitée à l'extérieur du plan de focalisation ne peut pas entrer dans le trou d'épingle de détection.
L'expression simple du principe de fonctionnement du laser confocal est qu'il utilise un laser comme source de lumière, et sur la base de l'imagerie au microscope à fluorescence traditionnelle, un dispositif de balayage laser et un dispositif de focalisation conjugué sont attachés, et l'acquisition et le traitement d'image numérique système est contrôlé par un ordinateur.
