Différence entre le microscope ordinaire et le microscope à fluorescence
Les microscopes à fluorescence utilisent la lumière ultraviolette comme source de lumière pour irradier l'objet à inspecter, de sorte que l'objet émette de la lumière, puis observez l'objet sous le microscope. Il est principalement utilisé pour les cellules d'immunofluorescence. Il est principalement composé d'une source lumineuse, d'un système de plaque filtrante et d'un système optique pour observer l'image fluorescente de l'échantillon à travers le grossissement de l'oculaire et de l'objectif. Voyons la différence entre ce microscope à fluorescence et un microscope optique ordinaire.
1. En termes de méthodes d'éclairage
La méthode d'éclairage du microscope à fluorescence est généralement épiscopique, c'est-à-dire que la source lumineuse est projetée sur l'échantillon à tester à travers l'objectif.
2. En termes de résolution
Les microscopes à fluorescence utilisent la lumière ultraviolette comme source de lumière. La longueur d'onde est relativement courte, mais la résolution est supérieure à celle des microscopes optiques ordinaires.
3. La différence dans le filtre
Le microscope à fluorescence utilise deux filtres spéciaux, qui sont utilisés devant la source lumineuse pour filtrer la lumière visible, et utilisés entre l'objectif et l'oculaire pour filtrer la lumière ultraviolette, qui peut protéger les yeux humains.
Le microscope à fluorescence est également une sorte de microscope optique, principalement parce que la longueur d'onde excitée par le microscope à fluorescence est courte, ce qui conduit à la différence de structure et d'utilisation entre le microscope à fluorescence et le microscope ordinaire. La plupart des microscopes à fluorescence ont une bonne fonction de capture de lumière faible, donc sous une fluorescence extrêmement faible, sa capacité d'imagerie est également bonne. Couplé à l'amélioration continue des microscopes à fluorescence ces dernières années, le bruit a également été fortement réduit. C'est pourquoi de plus en plus de microscopes à fluorescence sont utilisés.
Connaissance de la microscopie à fluorescence à deux photons
Le principe de base de l'excitation à deux photons est le suivant : dans le cas d'une densité de photons élevée, les molécules fluorescentes peuvent absorber deux photons de grande longueur d'onde en même temps et émettre un photon de plus courte longueur d'onde après une courte période dite de durée de vie de l'état excité. . ; l'effet est le même que l'utilisation d'un photon dont la longueur d'onde est la moitié de la longueur d'onde longue pour exciter une molécule fluorescente. L'excitation à deux photons nécessite une densité de photons élevée. Afin de ne pas endommager les cellules, la microscopie à deux photons utilise des lasers pulsés à verrouillage de mode à haute énergie. Le laser émis par ce laser a une énergie de crête élevée et une énergie moyenne faible, sa largeur d'impulsion n'est que de 100 femtosecondes et sa fréquence peut atteindre 80 à 100 mégahertz. Lors de l'utilisation d'une lentille d'objectif à grande ouverture numérique pour focaliser les photons du laser pulsé, la densité de photons au point focal de la lentille d'objectif est la plus élevée, et l'excitation à deux photons ne se produit qu'au point focal de la lentille d'objectif, donc le microscope à deux photons n'a pas besoin d'un trou d'épingle confocal, ce qui améliore l'efficacité de détection de fluorescence.
Dans les phénomènes généraux de fluorescence, en raison de la faible densité de photons de la lumière d'excitation, une molécule fluorescente ne peut absorber qu'un seul photon à la fois, puis émettre un photon fluorescent à travers une transition radiative, qui est la fluorescence monophotonique. Pour le processus d'excitation de fluorescence utilisant un laser comme source de lumière, une fluorescence à deux photons ou même à plusieurs photons peut se produire. A ce moment, l'intensité de la source lumineuse d'excitation utilisée est élevée et la densité de photons répond aux exigences des molécules fluorescentes absorbant deux photons en même temps. Dans le processus d'utilisation d'un laser général comme source de lumière d'excitation, la densité de photons n'est toujours pas suffisante pour produire le phénomène d'absorption à deux photons. Habituellement, un laser pulsé femtoseconde est utilisé, et sa puissance instantanée peut atteindre l'ordre du mégawatt. Par conséquent, la longueur d'onde de la fluorescence à deux photons est plus courte que la longueur d'onde de la lumière d'excitation, ce qui équivaut à l'effet produit par l'excitation à la moitié de la longueur d'onde d'excitation.
La microscopie à fluorescence à deux photons présente de nombreux avantages :
1) La lumière à grande longueur d'onde est moins affectée par la diffusion que la lumière à courte longueur d'onde et pénètre facilement dans l'échantillon ;
2) Les molécules fluorescentes à l'extérieur du plan focal ne sont pas excitées, de sorte que plus de lumière d'excitation peut atteindre le plan focal, de sorte que la lumière d'excitation puisse pénétrer des spécimens plus profonds ;
3) La lumière proche infrarouge à grande longueur d'onde est moins toxique pour les cellules que la lumière à courte longueur d'onde;
4) Lors de l'utilisation d'un microscope à deux photons pour observer des échantillons, le photoblanchiment et la phototoxicité ne se produisent que dans le plan focal. Par conséquent, la microscopie à deux photons est plus appropriée que la microscopie à photon unique pour observer des spécimens épais, pour observer des cellules vivantes ou pour des expériences de photoblanchiment ponctuel.
Connaissance de la microscopie confocale à fluorescence
Le principe de base de la microscopie confocale à fluorescence : une source lumineuse ponctuelle est utilisée pour irradier l'échantillon et une petite tache lumineuse bien définie se forme sur le plan focal. composé de séparateurs. Le séparateur de faisceau envoie la fluorescence directement au détecteur. Il y a un trou d'épingle devant la source lumineuse et le détecteur, respectivement appelé trou d'épingle d'éclairage et trou d'épingle de détection. La taille géométrique des deux est la même, environ 100-200 nm ; par rapport à la tache lumineuse sur le plan focal, les deux sont conjugués, c'est-à-dire que la tache lumineuse traverse une série de lentilles et peut finalement être focalisée sur le sténopé d'éclairage et le sténopé de détection en même temps. De cette manière, la lumière provenant du plan focal peut être convergée dans la portée du trou de détection, tandis que la lumière diffusée provenant du dessus ou du dessous du plan focal est bloquée à l'extérieur du trou de détection et ne peut pas être imagée. Le laser scanne l'échantillon point par point, et le tube photomultiplicateur après avoir détecté le trou d'épingle obtient également l'image confocale de la lumière correspondante point par point, qui est convertie en un signal numérique et transmise à l'ordinateur, et enfin agrégée en un clair image confocale de tout le plan focal sur l'écran.
Chaque image du plan focal est en fait une coupe transversale optique de l'échantillon. Cette section optique a toujours une certaine épaisseur, également appelée section mince optique. Étant donné que l'intensité lumineuse au point focal est bien supérieure à celle du point non focalisé et que la lumière du plan non focal est filtrée par le trou d'épingle, la profondeur de champ du système confocal est approximativement nulle et le balayage le long du Z -axe peut réaliser une tomographie optique, formant un Observez la section optique bidimensionnelle au point focalisé de l'échantillon. En combinant le balayage du plan XY (plan focal) avec le balayage de l'axe Z (axe optique), l'image tridimensionnelle de l'échantillon peut être obtenue en accumulant des images bidimensionnelles de couches continues et traitées par un logiciel informatique spécial.
C'est-à-dire que le trou d'épingle de détection et le trou d'épingle de source lumineuse sont toujours focalisés sur le même point, de sorte que la fluorescence excitée à l'extérieur du plan focal ne peut pas entrer dans le trou d'épingle de détection.
L'expression simple du principe de fonctionnement du laser confocal est qu'il utilise le laser comme source de lumière, et sur la base de l'imagerie au microscope à fluorescence traditionnelle, ajoute un dispositif de balayage laser et un dispositif de focalisation conjugué, et est un système d'acquisition d'images numériques et traitement par commande informatique.
