Différences, avantages et inconvénients entre la microscopie à fluorescence par transmission et la microscopie à fluorescence par réflexion
1. Microscope à fluorescence à transmission : la source de lumière d'excitation est transmise à travers le matériau de l'échantillon via un condenseur pour exciter la fluorescence. Des concentrateurs de champ sombre couramment utilisés, ou des concentrateurs ordinaires, peuvent être utilisés pour ajuster le réflecteur afin de convertir la lumière d'excitation et la lumière latérale sur l'échantillon. Il s’agit d’un microscope à fluorescence relativement ancien. Son avantage est une forte fluorescence à faible grossissement, tandis que son inconvénient est que sa fluorescence s'affaiblit avec l'augmentation du grossissement. Il est donc préférable d’observer des échantillons de plus grande taille.
2. Microscope à fluorescence à faisceau descendant : Il s'agit d'un nouveau type de microscope à fluorescence qui s'est développé dans les temps modernes. Contrairement à la précédente, la lumière d'excitation tombe de la lentille d'objectif sur la surface de l'échantillon, en utilisant la même lentille d'objectif que le condenseur d'éclairage et la lentille d'objectif pour collecter la fluorescence. Un séparateur de faisceau bicolore doit être ajouté au chemin optique, qui forme un angle de 45 degrés avec le photouranium. La lumière d'excitation est réfléchie dans la lentille de l'objectif et se rassemble sur l'échantillon. La fluorescence générée par l'échantillon et la lumière d'excitation réfléchie par la surface de la lentille d'objectif et du verre de protection entrent simultanément dans la lentille d'objectif et retournent au séparateur de faisceau bicolore, séparant la lumière d'excitation et la fluorescence. La lumière d'excitation résiduelle est ensuite absorbée par le filtre bloquant. Si différentes combinaisons de filtres d'excitation, de séparateurs de faisceaux bicolores et de filtres de blocage sont utilisées, elles peuvent répondre aux besoins de différents produits de réaction fluorescents. Les avantages de ce microscope fluorescent sont un éclairage uniforme du champ de vision, une imagerie claire et une fluorescence plus forte avec un grossissement plus élevé.
Les avantages et les inconvénients de la microscopie à fluorescence par transmission
Source lumineuse : Lampe au mercure haute pression ou lampe halogène.
Miroir de projecteur : utilisation d'un projecteur à champ sombre pour séparer l'excitation et la fluorescence.
Objectif : Tout type d’objectif peut être utilisé.
Spécimen : Les spécimens minces conviennent mieux à l’observation de la transmission.
Avantages : ① En raison de l'utilisation d'un condenseur de champ sombre, la lumière d'excitation ne peut pas pénétrer dans l'objectif, ce qui facilite la formation d'un fond sombre et l'obtention d'un bon contraste, et n'importe quel objectif peut être utilisé pour l'observation. ② Lorsque vous utilisez un objectif à faible grossissement, il est plus lumineux qu'un microscope à fluorescence réfléchissante.
Inconvénient : Le centre et la hauteur du projecteur doivent être réglés correctement, sinon une image fluorescente lumineuse ne peut pas être obtenue. En raison de la limitation de la distance focale du projecteur à fond noir, des lames de verre épaisses ne peuvent pas être utilisées. La zone d'éclairage du champ de vision ne doit pas être trop grande, sinon la couleur de fluorescence de l'échantillon fluorescent pourrait s'estomper. Les échantillons épais ou opaques ne conviennent pas.
Les avantages et les inconvénients de la microscopie à fluorescence réflective
Source lumineuse : Lampe au mercure haute pression ou lampe halogène.
Objectif de mise au point : Comme l'objectif sert de lentille de mise au point, il n'est pas nécessaire d'utiliser un objectif de mise au point.
Objectif : L'objectif utilisé doit être capable de transmettre suffisamment de lumière ultraviolette et de ne pas produire de fluorescence elle-même, sans limitation d'ouverture numérique.
Spécimen : Des spécimens épais et opaques peuvent être observés.
Avantages : ① Comme l'objectif sert également de projecteur, il ne nécessite pas beaucoup de réglage. ② En utilisant la méthode d'éclairage Kolar, les effets des ouvertures d'ouverture et de champ de vision peuvent être utilisés. L'ouverture numérique de l'objectif n'est pas limitée et des images haute résolution peuvent également être obtenues à fort grossissement. Des échantillons épais ou opaques peuvent également être observé, et des lamelles épaisses peuvent également être utilisées. D'autres méthodes d'observation peuvent également être combinées avec la fluorescence réfléchie, en particulier avec la méthode de différence de phase et la méthode d'interférence différentielle de transmission. Cela peut éviter un phénomène inutile de décoloration de la fluorescence.
Inconvénient : Lors de l'utilisation d'un objectif à grossissement au sol, l'image est relativement sombre, il faut donc utiliser un objectif à grande ouverture numérique. Le système de filtre doit séparer efficacement la luminescence d'excitation et la fluorescence.
