Comptage direct des micro-organismes au microscope
Principe expérimental
Le comptage direct au microscope à l’aide d’un hémocytomètre est une méthode de comptage microbien couramment utilisée. L’avantage de cette méthode est qu’elle est intuitive et rapide. Placer la suspension bactérienne (ou suspension de spores) correctement diluée dans la chambre de comptage entre la lame et le couvercle en verre de l'hémocytomètre et compter au microscope. Le volume de la chambre de comptage étant fixe (0,1 mm2), il peut être converti en nombre total de micro-organismes par unité de volume en fonction du nombre de micro-organismes observés au microscope. Parce que cette méthode compte la somme des bactéries vivantes et mortes, elle est également appelée méthode de comptage total des bactéries.
Un hémocytomètre est généralement une lame de verre spéciale sur laquelle quatre rainures forment trois plates-formes. La plate-forme au milieu est divisée en deux moitiés par une courte rainure horizontale. Une grille est gravée sur la plateforme de chaque côté. Chaque grille est divisée en neuf grands carrés. La grande place au milieu est la salle de comptage. Les micro-organismes sont comptés dans la chambre de comptage. La structure du tableau de comptage des cellules sanguines est illustrée à la figure Ⅷ -1.
L'échelle de la salle de comptage a généralement deux spécifications, l'une est qu'un grand carré est divisé en 16 carrés du milieu et chaque carré du milieu est divisé en 25 petits carrés (Figure Ⅷ-2) ; l'autre est un grand carré. Le carré est divisé en 25 carrés du milieu, et chaque carré du milieu est divisé en 16 petits carrés (Figure Ⅷ-1, C). Mais quel que soit le type de tableau de comptage, le nombre de petits carrés dans chaque grand carré est le même, c'est-à-dire 16×25=400 petits carrés, comme le montre la figure Ⅷ-2.
La longueur du côté de chaque grand carré est de 1 mm et l'aire de chaque grand carré est de 1 mm2. Une fois le couvre-objet recouvert, la hauteur entre le verre coulissant et le couvre-objet est de 0,1 mm, le volume de la chambre de comptage est donc de 0,1 mm3.
Lors du comptage, comptez généralement le nombre total de bactéries dans les cinq grilles du milieu, puis obtenez la valeur moyenne de chaque grille du milieu, puis multipliez par 16 ou 25 pour obtenir le nombre total de bactéries dans une grande grille, puis convertissez-le en nombre total de bactéries dans 1 ml de solution bactérienne.
Équipement de laboratoire
Hémocytomètre, microscope, lamelle, capillaire stérile ;
Matériaux expérimentaux
Suspension de Saccharomyces cerevisiae
Procédure expérimentale (méthode de comptage direct au microscope microbien)
1.dilution
Diluer correctement la suspension de Saccharomyces cerevisiae. Si la solution bactérienne n’est pas épaisse, il n’est pas nécessaire de la diluer.
2. Salle de comptage microscopique
Avant d’ajouter des échantillons, effectuez une inspection microscopique de la chambre de comptage de la plaque de comptage. S'il y a de la saleté, elle doit être nettoyée avant de compter.
3. ajouter un échantillon
Couvrez la plaque d'hémocytomètre propre et sèche avec un couvre-objet, puis utilisez un compte-gouttes stérile à bouche fine pour déposer une petite goutte de la solution diluée de Saccharomyces cerevisiae du bord du couvre-objet (pas trop), afin que la solution bactérienne est proche de l'écart le long de l'écart. L'osmose capillaire entre d'elle-même dans la chambre de comptage et la chambre de comptage générale peut être remplie de liquide bactérien. Faites attention à ne pas avoir de bulles d'air.
4. décompte au microscope
Après 5 minutes de repos, placez l'hémocytomètre sur la platine du microscope, utilisez d'abord une lentille de faible puissance pour trouver l'emplacement de la chambre de comptage, puis passez à une lentille de haute puissance pour compter. S'il s'avère que la solution bactérienne est trop épaisse ou trop liquide avant le comptage, il est nécessaire de réajuster la dilution avant le comptage. Généralement, la dilution de l'échantillon nécessite environ 5-10 bactéries dans chaque cellule. Chaque chambre de comptage sélectionne les bactéries dans 5 grilles centrales (4 coins et grilles centrales en option) pour le comptage. Les bactéries présentes sur la ligne de quadrillage ne sont généralement comptées que sur les lignes supérieure et droite. En cas de bourgeonnement de levure, lorsque la taille du corps du bourgeon atteint la moitié de la cellule mère, comptez deux bactéries. Comptez un échantillon pour calculer la teneur bactérienne de l'échantillon à partir des valeurs comptées dans les deux chambres de comptage.
5. Nettoyage de l'hémocytomètre
Après utilisation, rincez la plaque de comptage des cellules sanguines sur le robinet avec des jets d'eau, ne la lavez pas avec des objets durs et séchez-la vous-même ou avec un sèche-cheveux après le lavage. Examen microscopique, observez s'il y a des bactéries résiduelles ou d'autres sédiments dans chaque cellule. S'il n'est pas propre, il doit être lavé à plusieurs reprises jusqu'à ce qu'il soit propre.
