Caractéristiques et applications de la microscopie laser confocale
Le microscope confocal à balayage laser (LSCM) est un type de microscope conçu sur la base de la technologie de mise au point conjuguée, c'est-à-dire pour que la source de lumière laser, l'échantillon testé et le détecteur soient tous dans la position conjuguée l'un de l'autre.
Fondamental
Dans les microscopes généraux, le plan focal de l'objectif coïncide avec le détecteur de sorte que le plan d'image observé est isolé du plan axial adjacent, tandis que dans les microscopes confocaux, l'échantillon est éclairé à l'aide d'un spot lumineux à diffraction limitée, et dans le Cet effet d'isolement est obtenu en utilisant un trou d'épingle dans le trajet de la lumière de collecte au point focal du conjugué spot pour filtrer la lumière parasite afin d'améliorer la résolution.
Fonctions d'imagerie
Seule la lumière réfléchie par la couche d'échantillon conjugué peut passer à travers le petit trou dans le chemin de lumière de collecte, et les réflexions restantes non pertinentes de la couche d'échantillon sont bloquées par le petit trou. Cela peut entraîner une augmentation significative de la résolution. Vous trouverez ci-dessous une comparaison côte à côte de la microscopie à fluorescence multidimensionnelle et de la microscopie confocale du même échantillon épais. Lorsqu'une série d'images est prise à différents plans focaux, ce que l'on appelle communément une "pile z" peut être générée, et cette image montre à la fois les gains de résolution et de contraste offerts par la microscopie confocale et les causes sous-jacentes de ces gains. L'examen de l'image en haut de la pile avec le plan d'imagerie au-dessus du tissu révèle beaucoup de lumière diffusée dans l'image de fluorescence, tandis que l'image confocale apparaît noire. Cette réduction de PSF dans la direction axiale est directement responsable de la différence de résolution observée à l'interface optique au milieu de la pile z.
Une autre caractéristique de la microscopie confocale à balayage laser est qu'il s'agit d'une technologie d'imagerie à balayage. La technologie traditionnelle d'éclairage à large champ illumine l'ensemble de l'échantillon, de sorte que l'image peut être directement capturée à l'œil nu ou par un détecteur, mais LSCM utilise un faisceau ou plusieurs faisceaux focalisés traversent l'échantillon pour la numérisation et l'imagerie, et l'image résultante est appelée section optique. Ce qui suit montre la différence entre la méthode d'éclairage à grand champ traditionnelle et la méthode d'éclairage confocal à balayage laser.
Par conséquent, une méthode de travail pratique d'un microscope confocal moderne est illustrée dans la figure ci-dessous. La lumière d'excitation émise par le laser traverse un miroir dichroïque et balaye dans les directions x et y de l'échantillon à travers une paire de miroirs vibrants. L'excitation (ou la réflexion) de l'échantillon La lumière pénètre dans le détecteur PMT à travers le trou d'épingle et est enregistrée, et l'image de balayage enregistrée est reconstruite par l'ordinateur pour obtenir l'image réelle de l'échantillon.
