Application et utilisation du principe du microscope à fluorescence
(1) Le principe et les caractéristiques structurelles du microscope à fluorescence : le microscope à fluorescence utilise une source de lumière ponctuelle à haute efficacité lumineuse pour émettre une lumière d'une certaine longueur d'onde (telle que la lumière ultraviolette de 3 650 pouces ou la lumière bleue violette de 4 200 pouces) à travers le système de filtre. comme lumière d'excitation pour exciter l'échantillon. Une fois que la substance fluorescente à l’intérieur émet une fluorescence de différentes couleurs, elle est observée grâce au grossissement de l’objectif et de l’oculaire. De cette façon, sous un fond fortement contrasté, même si la fluorescence est très faible, il est facile à identifier et présente une sensibilité élevée. Il est principalement utilisé pour la recherche de la structure, de la fonction et de la composition chimique des cellules. La structure de base d'un microscope à fluorescence est composée d'un microscope optique ordinaire et de quelques accessoires (tels qu'une source de lumière fluorescente, un filtre d'excitation, un séparateur de faisceau bicolore et un filtre de blocage, etc.). Source de lumière fluorescente : utilisez généralement une lampe au mercure à ultra haute pression (50-200 W), qui peut émettre de la lumière de différentes longueurs d'onde, mais chaque substance fluorescente a une longueur d'onde d'excitation qui produit la fluorescence la plus forte, donc un filtre d'excitation (généralement, il existe des filtres d'excitation ultraviolets, violets, bleus et verts), qui permettent uniquement à la lumière d'excitation d'une certaine longueur d'onde de traverser et d'irradier l'échantillon, tout en absorbant une autre lumière. Une fois que chaque substance est irradiée par une lumière d’excitation, elle émet une fluorescence visible avec une longueur d’onde plus longue que la longueur d’onde d’irradiation en très peu de temps. La fluorescence est spécifique et généralement plus faible que la lumière d'excitation. Afin d'observer une fluorescence spécifique, un filtre bloquant (ou supprimant) est nécessaire derrière l'objectif. Il a deux fonctions : l'une consiste à absorber et à empêcher la lumière d'excitation de pénétrer dans l'oculaire, afin de ne pas perturber la fluorescence et d'endommager les yeux ; l'autre consiste à sélectionner et à laisser passer la fluorescence spécifique, montrant une couleur fluorescente spécifique. Les deux filtres doivent être utilisés ensemble.
Il existe deux types de microscopes à fluorescence en fonction de leurs trajets optiques :
1. Microscope à fluorescence à transmission : la source de lumière d'excitation traverse le matériau de l'échantillon à travers une lentille condensatrice pour exciter la fluorescence. Un collecteur de champ sombre est couramment utilisé, et un collecteur ordinaire peut également être utilisé pour ajuster le miroir afin que la lumière d'excitation soit redirigée et contournée vers l'échantillon. Il s'agit d'un microscope fluorescent plus ancien. L’avantage est que la fluorescence est forte à faible grossissement, mais l’inconvénient est qu’elle diminue avec l’augmentation du grossissement. Il est donc préférable d’observer des échantillons de plus grande taille.
2. Le microscope à épifluorescence est un nouveau type de microscope à fluorescence développé dans les temps modernes. La différence est que la lumière d'excitation tombe de la lentille d'objectif jusqu'à la surface de l'échantillon, c'est-à-dire que la même lentille d'objectif est utilisée comme condenseur d'éclairage et comme lentille d'objectif pour collecter la fluorescence. Un séparateur de faisceau dichroïque doit être ajouté dans le trajet lumineux, qui est à 45 degrés de l'uranium léger. La lumière d'excitation est réfléchie dans la lentille de l'objectif et collectée sur l'échantillon. La fluorescence générée par l'échantillon et la lumière d'excitation réfléchie par la surface de la lentille de l'objectif et la surface du verre de protection entrent dans la lentille de l'objectif en même temps et retournent au séparateur de faisceau bicolore pour séparer la lumière d'excitation de la fluorescence. , la lumière d'excitation résiduelle est absorbée par des filtres bloquants. Comme le passage à une combinaison de différents filtres d'excitation/séparateur de faisceau bicolore/filtre de blocage, il peut répondre aux besoins de différents produits de réaction fluorescents. L'avantage de ce type de microscope à fluorescence est que l'éclairage du champ de vision est uniforme, l'imagerie est claire et plus le grossissement est grand, plus la fluorescence est forte.
(2) Comment utiliser le microscope à fluorescence.
1. Allumez la source de lumière et la lampe au mercure ultra haute pression doit se réchauffer pendant quelques minutes pour atteindre le point le plus lumineux.
2. Le microscope à fluorescence à transmission doit installer le filtre d'excitation requis entre la source de lumière et le condenseur, et installer le filtre de blocage correspondant derrière l'objectif. Les microscopes à épifluorescence doivent insérer les inserts de filtre d'excitation/séparateur de faisceau bicolore/filtre de blocage requis dans les fentes du trajet lumineux.
3. Observez avec une lentille à faible grossissement et ajustez le centre de la source lumineuse afin qu'elle soit située au centre de l'ensemble du point d'éclairage selon le dispositif de réglage des différents modèles de microscopes à fluorescence.
4. Placez l'échantillon et observez après la mise au point. Il faut faire attention lors de l'utilisation : ne pas observer directement avec le filtre d'extrémité, afin de ne pas causer de dommages aux yeux ; lors de l'observation d'échantillons avec une lentille à huile, une lentille à huile spéciale sans fluorescence doit être utilisée ; une fois la lampe au mercure haute pression éteinte, elle ne peut pas être rallumée immédiatement, elle doit être testée. Elle peut être redémarrée après 5 minutes, sinon elle sera instable et affectera la durée de vie de la lampe au mercure.
(3) Observez les cellules colorées avec 0,01 pour cent de colorant fluorescent orange acridine sous le microscope fluorescent sur la plate-forme d'enseignement avec un filtre de lumière bleu-violet. Le noyau et le cytoplasme sont excités pour produire deux couleurs de fluorescence différentes (vert foncé et rouge orange).
