Paramètres techniques de la microscopie à fluorescence Techniques et méthodes de microscopie à fluorescence
Paramètres techniques du microscope à fluorescence 1. Oculaire grand angle 2. Lentille d'objectif achromatique 3. Convertisseur de lentille d'objectif à quatre trous 4. Dispositif épifluorescent Système d'excitation bleu (B) vert (G) 10Lampe au mercure 0W 5. Mécanisme coaxial de réglage de mise au point grossière et fine : réglage Plage de mise au point : 15 mm Valeur de grille de micro-mouvement : 0,002 mm 6. Table mécanique à double couche Plage de mouvement longitudinal : 70 mm Plage de mouvement latéral : 50 mm
Paramètres techniques du microscope à fluorescence
1. Oculaire grand angle
2. Objectif achromatique
3. Embout nasal à quatre ouvertures
4. Dispositif d'épifluorescence bleu (B) vert (G) système d'excitation lampe au mercure 100W
5. Mécanisme coaxial de réglage de la mise au point grossière et fine : plage de mise au point 15 mm valeur de grille de mouvement fin 0.002 mm
6. Établi mécanique à double couche
Plage de mouvement vertical : 70 mm Plage de mouvement latéral : 50 mm
Compétences et méthodes de microscopie à fluorescence
(1) lame de verre
L'épaisseur de la lame de verre doit être comprise entre 0.8 et 1.2 mm. Une lame trop épaisse absorbera plus de lumière d'une part, et d'autre part, la lumière d'excitation ne pourra pas être concentrée sur l'échantillon. Les lames doivent être lisses, d'épaisseur uniforme et exemptes d'autofluorescence évidente. Parfois, des lames de verre de quartz sont utilisées.
(2) Verre de couverture
L'épaisseur du verre de protection est d'environ 0.17 mm, lisse. Afin de renforcer la lumière d'excitation, un verre de protection interférentiel peut également être utilisé, qui est un verre de protection spécial recouvert de plusieurs couches de substances (telles que le fluorure de magnésium) qui ont des effets d'interférence différents sur la lumière de différentes longueurs d'onde, ce qui peut rendre le la fluorescence se passe bien. La lumière d'excitation est traversée et réfléchie, et cette lumière d'excitation réfléchie excite l'échantillon.
(3) Spécimen
Les tranches de tissus ou autres spécimens ne doivent pas être trop épais. S'il est trop épais, la majeure partie de la lumière d'excitation sera consommée dans la partie inférieure de l'échantillon, tandis que la partie supérieure directement observée par l'objectif ne sera pas complètement excitée. De plus, le chevauchement des cellules ou la couverture d'impuretés affectent le jugement.
(4) Agent de montage
La glycérine est couramment utilisée comme agent de montage, qui ne doit pas avoir d'autofluorescence, incolore et transparente, et la luminosité de la fluorescence est plus brillante à pH 8.5-9.5, et il n'est pas facile de s'estomper rapidement. Par conséquent, un mélange égal de glycérol et de solution tampon de carbonate 0.5mol/l avec un pH de 9.0 à 9,5 est couramment utilisé comme agent de montage.
(5) huile miroir
Généralement, lors de l'observation d'échantillons avec des microscopes à fluorescence à fond noir et des lentilles d'immersion à immersion dans l'huile, de l'huile d'immersion doit être utilisée. Il est préférable d'utiliser une huile d'immersion spéciale non fluorescente. La glycérine ci-dessus peut également être utilisée à la place, et la paraffine liquide peut également être utilisée, mais l'indice de réfraction est faible, ce qui a un léger impact sur la qualité de l'image. Influence.
Le principe et les caractéristiques structurelles du microscope à fluorescence
La microscopie à fluorescence utilise un point avec une efficacité lumineuse élevée pour émettre de la lumière d'une certaine longueur d'onde (telle que la lumière ultraviolette 3650 pouces ou la lumière bleue violette 4200 pouces) à travers le système de filtre comme lumière d'excitation pour exciter les substances fluorescentes dans l'échantillon pour émettre la fluorescence de différentes couleurs Après cela, observez à travers le grossissement de l'objectif et de l'oculaire. De cette manière, sous un fond à fort contraste, même si la fluorescence est très faible, il est facile à identifier et présente une grande sensibilité. Il est principalement utilisé pour la recherche de la structure et de la fonction cellulaire et de la composition chimique. La structure de base d'un microscope à fluorescence est composée d'un microscope optique ordinaire plus quelques accessoires (tels qu'une source de lumière fluorescente, un filtre d'excitation, un séparateur de faisceau bicolore et un filtre de blocage, etc.). Source de lumière fluorescente : utilisez généralement une lampe au mercure à ultra haute pression (50-200W), qui peut émettre de la lumière de différentes longueurs d'onde, mais chaque substance fluorescente a une longueur d'onde d'excitation qui produit la fluorescence la plus forte, donc un filtre d'excitation (généralement, il existe des filtres d'excitation ultraviolets, violets, bleus et verts), qui ne laissent passer que la lumière d'excitation d'une certaine longueur d'onde et irradient l'échantillon, tout en absorbant une autre lumière. Après que chaque substance a été irradiée par une lumière d'excitation, elle émet une fluorescence visible avec une longueur d'onde plus longue que la longueur d'onde d'irradiation en un temps très court. La fluorescence est spécifique et généralement plus faible que la lumière d'excitation. Afin d'observer une fluorescence spécifique, un blocage (ou une suppression) doit être ajouté derrière la lentille d'objectif et utilisé conjointement avec celle-ci.
La différence entre le microscope à fluorescence et le microscope ordinaire
1. La méthode d'éclairage est généralement épiscopique, c'est-à-dire que la source lumineuse est projetée sur l'échantillon à travers l'objectif ;
2. La source lumineuse est la lumière ultraviolette, la longueur d'onde est plus courte et la résolution est supérieure à celle des microscopes ordinaires.
3. Il y a deux filtres spéciaux, celui devant la source lumineuse est utilisé pour filtrer la lumière visible, et celui entre l'oculaire et l'objectif est utilisé pour filtrer les rayons ultraviolets afin de protéger l'œil humain.
Le microscope à fluorescence est également une sorte de microscope optique, la principale différence est que la longueur d'onde d'excitation des deux est différente. Cela détermine la différence entre le microscope à fluorescence et le microscope optique ordinaire en termes de structure et d'utilisation.
La microscopie à fluorescence est un outil essentiel en cytochimie immunofluorescente. Il est composé de composants principaux tels que la source lumineuse, le système de plaque filtrante et le système optique. Il consiste à utiliser une certaine longueur d'onde de lumière pour exciter l'échantillon à émettre de la fluorescence, et à observer l'image de fluorescence de l'échantillon en amplifiant le système d'objectif et d'oculaire.
