Observation de fluorescence au microscope optique
La fluorescence fait référence au processus par lequel une substance fluorescente émet de la lumière avec une longueur d'onde plus longue presque simultanément lorsqu'elle est irradiée avec une lumière d'une longueur d'onde spécifique (Figure 1). Lorsque la lumière d'une longueur d'onde spécifique (longueur d'onde d'excitation) frappe une molécule, comme celles d'un fluorophore, l'énergie des photons est absorbée par les électrons de la molécule. Ensuite, les électrons passent de l'état fondamental (S0) à un niveau d'énergie supérieur, l'état excité (S1'). Ce processus est appelé excitation①. L'électron reste dans l'état excité pendant 10-9–10-8 secondes, pendant lesquelles l'électron perd de l'énergie②. Pendant le processus des électrons quittant l'état excité (S1) et retournant à l'état fondamental③, l'énergie restante absorbée pendant le processus d'excitation est libérée.
Diagramme de Jablonski fluorescent
Le temps de séjour de la molécule fluorescente à l'état excité est la durée de vie de fluorescence, qui est généralement de l'ordre de la nanoseconde, et est une caractéristique inhérente à la molécule fluorescente elle-même. L'imagerie à vie de fluorescence (FLIM), qui utilise la technologie d'imagerie à vie de fluorescence, peut effectuer des mesures fonctionnelles plus approfondies en plus de l'imagerie d'intensité de fluorescence, et obtenir la conformation moléculaire, les interactions intermoléculaires, le microenvironnement des molécules, etc. obtenir avec l'imagerie optique conventionnelle.
Une autre propriété importante de la fluorescence est le décalage de Stokes, la différence de longueur d'onde entre les pics d'excitation et d'émission (Figure 2). Typiquement, la longueur d'onde d'émission est plus longue que la longueur d'onde d'excitation. En effet, les électrons perdront une partie de leur énergie par le processus de relaxation après l'excitation de la substance fluorescente et avant la libération des photons. Les substances fluorescentes avec des décalages de Stokes plus importants sont plus faciles à observer sous un microscope à fluorescence.
microscope à fluorescence
Le microscope à fluorescence est un microscope optique qui utilise les propriétés de fluorescence pour l'observation et l'imagerie, et est largement utilisé dans divers domaines tels que la biologie cellulaire, la neurobiologie, la botanique, la microbiologie, la pathologie et la génétique. L'imagerie par fluorescence présente les avantages d'une sensibilité et d'une spécificité élevées, et convient très bien à l'observation de la distribution de protéines et d'organites spécifiques dans les tissus et les cellules, à l'étude de la colocalisation et de l'interaction, au suivi des processus dynamiques de la vie tels que les changements de concentration d'ions , etc.
La plupart des molécules dans les cellules ne sont pas fluorescentes, et si vous voulez les voir, vous les étiquetez en fluorescence. Il existe de nombreuses méthodes de marquage fluorescent, telles que le marquage direct (comme l'utilisation de DAPI pour marquer l'ADN), ou l'immunomarquage utilisant les propriétés de liaison à l'antigène des anticorps, ou l'utilisation de protéines fluorescentes (telles que la GFP, la protéine fluorescente verte) pour marquer les protéines cibles. , et reliure réversible. colorants synthétiques (tels que Fura-2), etc.
Microscope à fluorescence inversé MF53-N
À l'heure actuelle, le microscope à fluorescence est devenu l'équipement d'imagerie standard de divers laboratoires et plates-formes d'imagerie, et est une bonne aide pour nos expériences quotidiennes. Les microscopes à fluorescence sont principalement divisés en trois catégories : les microscopes à fluorescence droits (adaptés à la section), les microscopes à fluorescence inversés (adaptés aux cellules vivantes, en tenant compte de la section), les stéréoscopes à fluorescence (adaptés aux spécimens plus grands, tels que les plantes, les poissons zèbres (adulte/embryon ) , medaka, organes de souris/rat, etc.).
La technologie d'imagerie par microscopie à fluorescence est largement utilisée et riche en types, et de nouvelles technologies émergent encore. Vous pouvez choisir la technologie pour effectuer vos propres recherches.
