En quoi la microscopie à fluorescence diffère de la microscopie conventionnelle
J'ai récemment essayé de réaliser des coupes congelées de souris et je dois maintenant utiliser un microscope à fluorescence pour voir si le virus que j'ai injecté se trouve dans la zone cérébrale souhaitée. Certains principes de base de la microscopie à fluorescence doivent être étudiés brièvement, et je les partagerai également ici.
Le microscope à fluorescence utilise la lumière ultraviolette comme source de lumière pour éclairer l'objet testé, provoquant l'émission d'une source de lumière par l'objet, puis l'observation de l'objet au microscope. Principalement utilisé pour les cellules d'immunofluorescence, il est composé d'une source de lumière, d'un système de plaque filtrante et d'un système optique pour observer l'image de fluorescence de l'échantillon grâce au grossissement de l'oculaire et de l'objectif. Jetons un coup d'œil à la différence entre ce microscope à fluorescence et un microscope optique ordinaire.
1. En termes de méthodes d'éclairage
La méthode d'éclairage d'un microscope à fluorescence utilise généralement une méthode de faisceau tombant, ce qui signifie que la source de lumière est projetée sur l'échantillon à tester à travers la lentille de l'objectif.
2. En termes de résolution
La microscopie à fluorescence utilise la lumière ultraviolette comme source de lumière, avec une longueur d'onde relativement courte mais une résolution plus élevée que les microscopes optiques ordinaires.
3. Différences sur le filtre
Un microscope à fluorescence utilise deux filtres spéciaux, l'un devant la source de lumière pour filtrer la lumière visible et l'autre entre l'objectif et l'oculaire pour filtrer la lumière ultraviolette, ce qui peut protéger les yeux.
La microscopie à fluorescence est également un type de microscope optique, principalement parce que la longueur d'onde excitée par la microscopie à fluorescence est courte, ce qui entraîne des différences dans la structure et l'utilisation de la microscopie à fluorescence et de la microscopie ordinaire. La plupart des microscopes à fluorescence ont une bonne fonction de capture de lumière faible, leur capacité d'imagerie est donc également bonne sous une fluorescence extrêmement faible. De plus, grâce à l’amélioration continue de la microscopie à fluorescence ces dernières années, le bruit a également été considérablement réduit. C’est pourquoi de plus en plus de microscopes à fluorescence sont utilisés.
Connaissances liées à la microscopie à fluorescence biphotonique
Le principe de base de l'excitation à deux photons est qu'à haute densité de photons, les molécules fluorescentes peuvent simultanément absorber deux photons de grande longueur d'onde et, après une courte période de vie dite de l'état excité, émettre un photon de longueur d'onde plus courte ; Son effet est le même que celui de l’utilisation d’un photon d’une longueur d’onde égale à la moitié de la longueur d’onde longue pour exciter des molécules fluorescentes. L'excitation à deux photons nécessite une densité de photons élevée et, pour éviter d'endommager les cellules, un laser à impulsions à mode verrouillé à haute énergie est utilisé dans un microscope à deux photons. Le laser émis par ce type de laser a une énergie de crête élevée et une énergie moyenne faible, avec une largeur d'impulsion de seulement 100 femtosecondes et une fréquence allant jusqu'à 80 à 100 mégahertz. Lorsque vous utilisez un objectif à haute ouverture numérique pour focaliser les photons d'un laser pulsé, la densité de photons au point focal de l'objectif est la plus élevée et l'excitation à deux photons ne se produit qu'au point focal de l'objectif. Par conséquent, un microscope à deux photons ne nécessite pas de sténopés confocaux, ce qui améliore l’efficacité de la détection par fluorescence.
Dans les phénomènes généraux de fluorescence, en raison de la faible densité de photons d'excitation, une molécule fluorescente ne peut absorber qu'un seul photon en même temps, puis émettre un photon fluorescent par transition de rayonnement, appelée fluorescence monophotonique. Pour le processus d'excitation de fluorescence utilisant le laser comme source de lumière, des phénomènes de fluorescence à deux photons, voire multiphotons, peuvent se produire. À l'heure actuelle, la source de lumière d'excitation utilisée est de haute intensité et la densité de photons répond à l'exigence selon laquelle les molécules fluorescentes absorbent deux photons simultanément. Lors de l'utilisation d'un laser typique comme source de lumière d'excitation, la densité de photons n'est toujours pas suffisante pour générer un phénomène d'absorption à deux photons. Généralement, des lasers à impulsions femtosecondes sont utilisés et leur puissance instantanée peut atteindre le niveau des mégawatts. Par conséquent, la longueur d'onde de la fluorescence à deux photons est plus courte que celle de l'excitation, ce qui équivaut à l'effet produit par une excitation à demi-longueur d'onde d'excitation.
