Introduction à la microscopie à fluorescence
La microscopie à fluorescence consiste à irradier l'objet coloré à la fluorescéine avec une lumière à courte longueur d'onde, de sorte qu'il soit excité pour produire une fluorescence à grande longueur d'onde, puis observé. Dans un microscope à fluorescence, la lumière d'excitation d'une longueur d'onde spécifique doit être sélectionnée à partir de la lumière d'éclairage de l'échantillon pour générer la fluorescence, puis la fluorescence doit être séparée de la lumière mixte de la lumière d'excitation et de la fluorescence pour l'observation. Par conséquent, le système de filtre joue un rôle extrêmement important dans la sélection d'une longueur d'onde spécifique. Les microscopes à fluorescence sont largement utilisés en biologie, en médecine et dans d'autres domaines.
1. Les principaux composants du microscope à fluorescence :
(A) Source lumineuse : la source lumineuse émet de la lumière de différentes longueurs d'onde (de l'ultraviolet à l'infrarouge). le
(B) Source de lumière du filtre d'excitation : à travers la lumière d'une longueur d'onde spécifique qui peut amener l'échantillon à produire de la fluorescence, tout en bloquant la lumière qui est inutile pour exciter la fluorescence. le
(C) Échantillons fluorescents : généralement colorés avec des pigments fluorescents. le
(D) Filtre de blocage : bloquer la lumière d'excitation qui n'est pas absorbée par l'échantillon et transmettre sélectivement la fluorescence, et certaines longueurs d'onde sont transmises sélectivement dans la fluorescence.
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2. Classification des microscopes à fluorescence :
Les microscopes à fluorescence sont généralement divisés en deux types : transmission et épi-émission :
un. Type de transmission : la lumière d'excitation provient du bas de l'objet à inspecter et le condenseur est un condenseur à fond noir, de sorte que la lumière d'excitation ne pénètre pas dans l'objectif, mais la fluorescence pénètre dans l'objectif. Il est clair à faible grossissement, mais sombre à fort grossissement. Il est difficile d'opérer en immersion et centrage dans l'huile. Il est particulièrement difficile de déterminer la plage d'éclairage à faible grossissement, mais cela peut obtenir un fond de champ de vision très sombre. Le type de transmission n'est pas utilisé pour les objets non transparents. le
b. Epi-type : Le type de transmission est presque éliminé à l'heure actuelle. La plupart des nouveaux microscopes à fluorescence sont de type épi. La source lumineuse vient du dessus de l'objet à inspecter et il y a un séparateur de faisceau dans le chemin optique, il convient donc aux objets transparents et opaques à inspecter. Étant donné que la lentille d'objectif agit comme une lentille de condenseur, elle est non seulement facile à utiliser, mais peut également obtenir un éclairage uniforme de tout le champ de vision, du faible grossissement au fort grossissement. le
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3. Précautions pour la fluoroscopie
un. L'irradiation à long terme de la lumière d'excitation entraînera une atténuation et une extinction de la fluorescence, donc raccourcissez le temps d'observation autant que possible et utilisez un déflecteur pour couvrir la lumière d'excitation lorsque vous n'observez pas temporairement. le
b. Lorsque vous observez avec une lentille à immersion dans l'huile, utilisez une "huile non fluorescente". le
c. La fluorescence est presque toujours faible et doit être effectuée dans une pièce sombre. le
d. Il est préférable d'installer un stabilisateur de tension dans l'alimentation, sinon la tension instable réduira non seulement la durée de vie de la lampe au mercure, mais affectera également l'effet de l'inspection au microscope. le
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4. Utilisation de la microscopie à fluorescence
1. Exigences de préparation pour les échantillons de microscope à fluorescence
un. Lame de verre
L'épaisseur de la lame de verre doit être comprise entre 0.8 et 1.2 mm. Une lame trop épaisse absorbera plus de lumière d'une part, et d'autre part, la lumière d'excitation ne pourra pas être concentrée sur l'échantillon. Les lames doivent être lisses, d'épaisseur uniforme et exemptes d'autofluorescence évidente. Parfois, des lames de verre de quartz sont utilisées. le
b. Lamelle de verre
L'épaisseur du verre de protection est d'environ 0.17 mm, lisse. Afin de renforcer la lumière d'excitation, un verre de protection sec peut également être utilisé, qui est un verre de protection spécial recouvert de plusieurs couches de substances (telles que le fluorure de magnésium) qui ont des effets d'interférence différents sur la lumière de différentes longueurs d'onde, ce qui peut rendre le la fluorescence se passe bien. La lumière d'excitation est traversée et la lumière d'excitation réfléchie excite l'échantillon. le
c. Spécimen
Les tranches de tissus ou autres spécimens ne doivent pas être trop épais. S'il est trop épais, la majeure partie de la lumière d'excitation sera consommée dans la partie inférieure de l'échantillon, tandis que la partie supérieure directement observée par l'objectif ne pourra pas être complètement excitée. De plus, le chevauchement des cellules ou les impuretés se recouvrent, affectant le jugement. le
d. Agent de montage
La glycérine est couramment utilisée comme agent de montage, qui ne doit pas avoir d'autofluorescence, incolore et transparente, et la luminosité de la fluorescence est plus brillante à pH 8.5-9.5, et il n'est pas facile de s'estomper rapidement. Par conséquent, un mélange égal de glycérol et de solution tampon de carbonate 0.5mol/L avec un pH de 9.0 à 9,5 est couramment utilisé comme agent de montage. le
e. miroir à l'huile
Généralement, l'huile d'immersion doit être utilisée lors de l'observation d'échantillons avec des microscopes à fluorescence à fond noir et des objectifs d'immersion à immersion dans l'huile. Il est préférable d'utiliser une huile de miroir spéciale non fluorescente, qui peut également être remplacée par la glycérine mentionnée ci-dessus, et de la paraffine liquide peut également être utilisée, mais l'indice de réfraction est faible, ce qui affecte légèrement la qualité de l'image.
