Connaissance de la microscopie à fluorescence à deux -photons
Le principe de base de l'excitation à deux -photons est qu'à haute densité de photons, les molécules fluorescentes peuvent simultanément absorber deux photons de grande longueur d'onde et émettre un photon de longueur d'onde plus courte après une courte période de -vie de vie à l'état excité ; L'effet est le même que celui de l'utilisation d'un photon dont la longueur d'onde est la moitié de la longueur d'onde longue pour exciter des molécules fluorescentes. L'excitation à deux photons nécessite une densité de photons élevée, et afin d'éviter d'endommager les cellules, la microscopie à deux -photons utilise des lasers à impulsions verrouillées en mode haute-énergie-. Le laser émis par ce laser a une énergie de crête élevée et une énergie moyenne faible, avec une largeur d'impulsion de seulement 100 femtosecondes et une fréquence allant jusqu'à 80 à 100 mégahertz. Lorsque vous utilisez un objectif à haute ouverture numérique pour focaliser les photons d'un laser pulsé, la densité de photons au point focal de l'objectif est la plus élevée et l'excitation à deux -photons ne se produit qu'au point focal de l'objectif. Par conséquent, le microscope à deux photons ne nécessite pas de trou d'épingle confocal, ce qui améliore l'efficacité de la détection de fluorescence.
Dans les phénomènes généraux de fluorescence, en raison de la faible densité de photons de la lumière d'excitation, une molécule fluorescente ne peut absorber qu'un photon à la fois, puis émettre un autre photon fluorescent par transition radiative, connue sous le nom de fluorescence à photon unique. Pour les processus d'excitation de fluorescence utilisant des lasers comme sources lumineuses, des phénomènes de fluorescence à deux-photons, voire multiphotons, peuvent se produire. Dans ce cas, la source de lumière d’excitation utilisée a une intensité et une densité de photons élevées qui répondent à l’exigence selon laquelle les molécules fluorescentes absorbent deux photons simultanément. Lors de l'utilisation d'un laser général comme source de lumière d'excitation, la densité de photons est encore insuffisante pour produire un phénomène d'absorption à deux -photons. On utilise généralement des lasers à impulsions femtosecondes, dont la puissance instantanée atteint le niveau du mégawatt. Par conséquent, la longueur d'onde de la fluorescence à deux -photons est plus courte que celle de la lumière d'excitation, équivalente à l'effet produit par une excitation à demi-longueur d'onde d'excitation.
