Connaissance du Microscope Confocal à Fluorescence
Le principe de base de la microscopie confocale à fluorescence : une source de lumière ponctuelle est utilisée pour irradier l'échantillon, formant un petit point lumineux bien défini sur le plan focal ; la fluorescence émise à partir de ce point après l'irradiation est collectée par la lentille d'objectif et renvoyée le long du trajet lumineux d'irradiation d'origine vers le séparateur de faisceau constitué d'un miroir chromatique bidirectionnel. Le séparateur de faisceau envoie la fluorescence directement au détecteur. La source lumineuse et le détecteur sont chacun dotés d'un trou d'épingle devant eux, appelés respectivement sténopé d'éclairage et sténopé de détection. Les deux ont la même géométrie, environ 100-200 nm, et sont conjugués par rapport au point lumineux sur le plan focal, c'est-à-dire que le point lumineux passe à travers une série de lentilles et peut finalement être focalisé à la fois sur l'élément lumineux. et les trous d'épingle du détecteur. De cette manière, la lumière provenant du plan focal peut converger à l’intérieur de l’ouverture de la sonde, tandis que la lumière diffusée au-dessus ou au-dessous du plan focal est bloquée à l’extérieur de l’ouverture de la sonde et ne peut pas être imagée. Le laser scanne l'échantillon point par point, et le tube photomultiplicateur après avoir détecté le sténopé obtient également l'image confocale de la lumière correspondante point par point, qui est convertie en signal numérique et transmise à l'ordinateur, et finalement converge vers un signal clair. image confocale de tout le plan focal sur l'écran.
Chaque image du plan focal est en fait une coupe transversale optique de l'échantillon, et cette coupe transversale optique a toujours une certaine épaisseur, également appelée feuille optique. Étant donné que l'intensité lumineuse au point focal est beaucoup plus grande que celle au point non focal et que la lumière du plan non focal est filtrée par le sténopé, la profondeur de champ du système confocal est estimée à zéro, et le balayage le long de la direction de l'axe Z, la tomographie optique permet de former une tranche optique bidimensionnelle de l'échantillon à observer au niveau du point focal. En combinant le balayage du plan XY (plan focal) avec le balayage de l'axe Z (axe optique), une image tridimensionnelle de l'échantillon peut être obtenue en accumulant des couches successives d'images bidimensionnelles, qui sont traitées par un logiciel informatique spécialisé.
Cela signifie que le sténopé de détection et le sténopé de la source lumineuse sont toujours focalisés au même point, de sorte que la fluorescence excitée en dehors du plan focal ne peut pas pénétrer dans le sténopé de détection.
Le principe de fonctionnement du laser confocal s'exprime simplement par le fait qu'il utilise le laser comme source de lumière, sur la base de l'imagerie traditionnelle au microscope à fluorescence, d'un dispositif de balayage laser supplémentaire et d'un dispositif de focalisation conjugué, via un contrôle informatique pour réaliser un système d'acquisition et de traitement d'images numériques.
