Connaissances liées à la microscopie confocale à fluorescence
Le principe de base de la microscopie confocale à fluorescence consiste à utiliser une source de lumière ponctuelle pour irradier l’échantillon, formant ainsi un petit point bien défini sur le plan focal. La fluorescence émise par le spot après irradiation est collectée par l'objectif et renvoyée au spectrophotomètre composé d'un miroir couleur bidirectionnel le long du trajet d'irradiation d'origine. Le spectrophotomètre envoie la fluorescence directement au détecteur. Il y a deux sténopés devant la source lumineuse et le détecteur, appelés respectivement sténopés d'éclairage et sténopés de détection. Les dimensions géométriques des deux sont cohérentes, environ 100-200 nm ; Par rapport au point lumineux sur le plan focal, les deux sont conjugués, ce qui signifie que le point lumineux traverse une série de lentilles et peut finalement se concentrer simultanément sur le sténopé d’éclairage et le sténopé de détection. De cette manière, la lumière provenant du plan focal peut converger dans la portée du trou de détection, tandis que la lumière diffusée au-dessus ou au-dessous du plan focal est bloquée à l'extérieur du trou de détection et ne peut pas être imagée. En balayant l'échantillon point par point avec un laser, le tube photomultiplicateur après détection du sténopé obtient également l'image confocale correspondante de la lumière point par point, qui est convertie en signal numérique et transmise à l'ordinateur. Enfin, une image confocale claire de l’ensemble du plan focal est synthétisée sur l’écran.
Chaque image du plan focal est en fait une coupe transversale optique de l'échantillon, qui présente toujours une certaine épaisseur, également appelée section mince optique. Du fait que l'intensité lumineuse au point focal est beaucoup plus grande que celle au point non focal et que la lumière du plan non focal est filtrée par des trous d'épingle, la profondeur de champ du système confocal est approximativement nulle. Le balayage le long de l'axe Z peut réaliser une tomographie optique, formant une tranche optique bidimensionnelle au point focal de l'échantillon observé. En combinant le balayage du plan XY (plan focal) avec le balayage de l'axe Z (axe optique), une image tridimensionnelle de l'échantillon peut être obtenue en accumulant des couches continues d'images bidimensionnelles et en les traitant avec un logiciel informatique spécialisé.
Le sténopé de détection et le sténopé de la source lumineuse sont toujours focalisés sur le même point, de sorte que la fluorescence excitée en dehors du plan de focalisation ne peut pas pénétrer dans le sténopé de détection.
L'expression simple du principe de fonctionnement de la microscopie confocale laser est qu'elle utilise un laser comme source de lumière et ajoute un dispositif de balayage laser et un dispositif de focalisation conjugué sur la base de l'imagerie par microscopie à fluorescence traditionnelle. Il s'agit d'un système contrôlé par un ordinateur pour l'acquisition et le traitement d'images numériques.
