Avantages améliorés de la microscopie multiphotonique à balayage laser
Le microscope multiphotonique à balayage laser constitue une amélioration majeure de la microscopie optique, principalement dans la capacité d'observer la structure profonde des cellules et des tissus vivants et fixes, et d'obtenir des structures multicouches claires et nettes du plan Z, c'est-à-dire des tranches optiques, à partir desquelles une structure solide tridimensionnelle de l'échantillon peut être construite. La microscopie confocale utilise une source de lumière laser qui est étendue pour remplir tout le plan focal arrière de l'objectif, puis traverse le système de lentilles de l'objectif pour converger vers de très petits points sur le plan focal de l'échantillon. En fonction de l'ouverture numérique de l'objectif, la taille du diamètre du point d'éclairage lumineux est d'environ 0,25 ~ 0,8 μm et la profondeur est d'environ 0,5 ~ 1,5. µm. La taille du point confocal est déterminée par la conception du microscope, la longueur d'onde du laser, les caractéristiques de l'objectif, le réglage de l'état de l'unité de numérisation et la nature de l'échantillon. Les microscopes de terrain ont une large plage d'éclairage et une grande profondeur d'éclairage, tandis que les microscopes confocaux concentrent l'éclairage sur un seul point focal du plan focal. L'avantage le plus fondamental d'un microscope confocal est la capacité de réaliser de fines sections optiques d'échantillons fluorescents épais (jusqu'à 50 μm ou plus), avec des épaisseurs de section d'environ 0,5 à 1,5 μm. Une série d'images de coupe optique peut être obtenue en déplaçant l'échantillon de haut en bas avec le moteur pas à pas de l'axe Z du microscope. L'acquisition des informations d'image est contrôlée dans le premier plan et n'est pas perturbée par des signaux émis depuis d'autres emplacements sur l'échantillon. Après avoir supprimé les effets de la fluorescence de fond et augmenté le rapport signal/bruit, le contraste et la résolution de l'image confocale sont considérablement améliorés par rapport aux images de fluorescence classiques éclairées sur le terrain. Dans de nombreux spécimens, de nombreux composants structurels complexes s’entrelacent pour former des systèmes complexes, mais une fois que suffisamment de sections optiques peuvent être acquises, nous pouvons les reconstruire en trois dimensions à l’aide d’un logiciel. Cette méthode expérimentale a été largement utilisée dans la recherche biologique pour élucider les relations structurelles et fonctionnelles complexes entre cellules ou tissus.
