Conception de microscopes à fluorescence et à champ clair à faible coût
Dans ce guide, je passerai en revue les principes de base de la microscopie à fluorescence et comment construire trois microscopes à fluorescence différents à faible coût. Ces systèmes coûtent généralement des milliers de dollars, mais des efforts récents les ont rendus plus faciles à obtenir. La conception que je présente ici utilise des smartphones, des reflex numériques et des microscopes USB. Toutes ces conceptions peuvent également être utilisées comme microscopes à champ ouvert.
Étape 1 : Présentation de la microscopie à fluorescence
Pour comprendre les concepts de base de la microscopie à fluorescence, imaginez les forêts denses, les arbres, les animaux, les arbustes et autres forêts qui vivent dans la forêt la nuit. Si vous éclairez la forêt avec une lampe de poche, vous verrez toutes ces structures et il est difficile d’imaginer des animaux ou des plantes spécifiques. En supposant que vous êtes uniquement intéressé à voir des arbustes de bleuets dans la forêt. Pour y parvenir, vous devez entraîner les lucioles à être attirées uniquement par les myrtilles, afin que lorsque vous regardez la forêt, seuls les myrtilles s'illuminent. On peut dire que vous avez marqué les myrtilles avec des lucioles, afin que vous puissiez voir les structures de myrtilles dans la forêt.
Dans cette analogie, la forêt représente l’échantillon entier, le bleuet représente la structure que vous souhaitez visualiser (comme des cellules spécifiques ou des organites subcellulaires) et les lucioles sont des composés fluorescents. La situation consistant à photographier avec une lampe de poche seule sans lucioles est similaire à celle d'un microscope à fond clair.
La prochaine étape consiste à comprendre les fonctions fondamentales des composés fluorescents (également appelés fluorophores). Les amas fluorescents sont en réalité de petits objets (à l'échelle nanométrique) conçus pour relier des structures spécifiques dans l'échantillon. Ils absorbent la lumière d’une gamme étroite de longueurs d’onde et réémettent la lumière d’une autre longueur d’onde. Par exemple, un groupe fluorescent peut absorber la lumière bleue (c'est-à-dire que le groupe fluorescent est excité par la lumière bleue) puis émettre à nouveau de la lumière verte. Habituellement, cela est résumé par les spectres d’excitation et d’émission (comme le montre la figure ci-dessus). Ces graphiques montrent les longueurs d'onde de la lumière absorbée par le fluorophore et les longueurs d'onde de la lumière émise par le fluorophore.
La conception du microscope est très similaire à celle d’un microscope à champ ouvert classique, avec deux différences principales. Premièrement, la lumière illuminant l’échantillon doit être à la longueur d’onde du groupe fluorescent excité (pour l’exemple ci-dessus, la lumière est bleue). Deuxièmement, le microscope n’a besoin que de collecter la lumière émise (lumière verte) tout en bloquant la lumière bleue. En effet, la lumière bleue est partout, mais la lumière verte ne provient que de structures spécifiques de l’échantillon. Pour bloquer la lumière bleue, les microscopes sont généralement équipés d'un filtre passe-long qui permet à la lumière verte de passer sans lumière bleue. Chaque filtre passe-long possède une longueur d'onde de coupure. Si la longueur d’onde de la lumière est supérieure à la longueur d’onde de coupure, elle peut traverser un filtre. Le nom est donc « Pass Longue Distance ». Les longueurs d'onde plus courtes sont bloquées.
Étape 2 : Modélisation d'un microscope à l'aide de l'optique optique
Il s’agit d’une étape supplémentaire dans la conception du principe de base d’un microscope. Il n'est pas nécessaire de construire un microscope à fluorescence, donc si vous ne voulez pas vous lancer dans l'optique, vous pouvez l'ignorer.
Les microscopes à champ clair et à fluorescence peuvent être modélisés à l'aide de dispositifs optiques à rayons. Le principe de base de l’optique des rayons est que le comportement de la lumière est similaire à celui de la lumière se propageant à partir d’une source lumineuse. Lorsque vous regardez autour de vous dans la pièce, vous verrez la lumière du soleil à l’extérieur de la fenêtre ou la lumière apportée par l’ampoule. Ensuite, la lumière est absorbée ou réfléchie par les objets de la pièce. Un peu de lumière réfléchie le fera faire face à vos yeux. Si un objet est éclairé, vous pouvez imaginer chaque point de l'objet émettant de la lumière dans toutes les directions (comme le montre l'image ci-dessus). La lentille, comme la lentille de nos yeux, concentre la lumière en un point afin que nous puissions voir l’objet. Sans lentille, la lumière continue de se propager vers l’extérieur et ne forme pas d’image.
