Conception de microscopes à fluorescence et à champ clair à faible coût
La microscopie à fluorescence est une méthode utilisée pour visualiser
Dans ce guide, je passerai en revue les bases de la microscopie à fluorescence et comment construire trois microscopes à fluorescence différents à faible coût. Ces systèmes coûtent généralement des milliers de dollars, mais des efforts ont été récemment déployés pour les rendre plus accessibles. Les conceptions que je présente ici utilisent un smartphone, un reflex numérique et un microscope USB. Toutes ces conceptions peuvent également être utilisées comme microscopes à fond clair.
Étape 1 : Présentation de la microscopie à fluorescence
Pour comprendre les concepts de base de la microscopie à fluorescence, imaginez une forêt dense la nuit, avec des arbres, des animaux, des buissons et d'autres forêts vivantes. Si vous braquez une torche dans la forêt, vous verrez toutes ces structures et aurez du mal à visualiser des animaux ou des plantes spécifiques. Supposons que vous souhaitiez uniquement voir des myrtilles dans la forêt. Pour ce faire, vous entraînez la luciole à être attirée uniquement par les myrtilles, de sorte que lorsque vous regardez la forêt, seuls les myrtilles s'illuminent. On pourrait dire que vous utilisez des lucioles pour marquer les bleuetières afin de pouvoir voir les structures des bleuets dans la forêt.
Dans cette analogie, la forêt représente l'échantillon entier, les myrtilles représentent les structures que l'on souhaite visualiser (par exemple des cellules spécifiques ou des organites subcellulaires) et les lucioles sont des composés fluorescents. Éclairer la torche seule sans les lucioles est similaire à la microscopie en champ clair.
La prochaine étape consiste à comprendre la fonction fondamentale des composés fluorescents (également appelés fluorophores). Les fluorophores sont en fait de petits objets (à l'échelle nanométrique) conçus pour relier des structures spécifiques dans un échantillon. Ils absorbent une gamme étroite de longueurs d’onde de lumière et réémettent une autre longueur d’onde de lumière. Par exemple, un fluorophore peut absorber la lumière bleue (c'est-à-dire que le fluorophore est excité par la lumière bleue) puis réémettre de la lumière verte. Ceci est généralement résumé par les spectres d’excitation et d’émission (ci-dessus). Ces diagrammes montrent la longueur d'onde de la lumière absorbée par le fluorophore et la longueur d'onde de la lumière émise par le fluorophore.
La conception du microscope est très similaire à celle d’un microscope à fond clair normal, avec deux différences principales. Premièrement, la lumière illuminant l’échantillon doit être à la longueur d’onde qui excite le fluorophore (pour l’exemple ci-dessus, la lumière est bleue). Deuxièmement, le microscope n’a besoin que de collecter la lumière émise (lumière verte) tout en bloquant la lumière bleue. En effet, la lumière bleue est partout, mais la lumière verte ne provient que de structures spécifiques de l’échantillon. Pour bloquer la lumière bleue, les microscopes sont généralement équipés d'un filtre passe-long qui laisse passer la lumière verte sans lumière bleue. Chaque filtre passe-long possède une longueur d'onde de coupure. Si la lumière a une longueur d’onde plus longue que la longueur d’onde de coupure, elle peut traverser le filtre. D'où le nom « passe longue ». Les longueurs d'onde plus courtes sont bloquées.
Étape 2 : Modélisation du microscope avec l'optique optique
Il s’agit d’une étape supplémentaire par rapport aux principes de base de la conception des microscopes. Il n'est pas nécessaire de construire un microscope à fluorescence, vous pouvez donc l'ignorer si vous ne souhaitez pas vous lancer dans l'optique.
Les microscopes à fond clair et à fluorescence peuvent être modélisés à l'aide de l'optique à rayons. Le principe de base de l’optique des rayons est que la lumière se comporte de la même manière que la lumière s’éloignant d’une source lumineuse. Lorsque vous regardez autour d’une pièce, vous voyez la lumière du soleil à l’extérieur d’une fenêtre ou d’une ampoule. La lumière est ensuite absorbée ou réfléchie par les objets de la pièce. Une partie de la lumière réfléchie la dirige vers vos yeux. Si l'objet est éclairé, vous pouvez imaginer chaque point de l'objet émettant de la lumière dans toutes les directions (ci-dessus). La lentille, comme la lentille de nos yeux, concentre la lumière en un point afin que nous puissions voir l’objet. Sans lentille, la lumière continue de se propager vers l’extérieur et ne forme pas d’image.
Alors, comment fabriquer des systèmes optiques qui grossissent les petits objets ? Pour comprendre la conception, il suffit de connaître deux équations : les équations d'imagerie et de grossissement des lentilles fines :
1/f=1/si + 1/donc
M=-si/donc
f est la distance focale de l'objectif. Une distance focale plus courte signifie que l'objectif a une plus grande puissance de mise au point.
Il en va de même pour la distance des objets ; la distance entre l'objectif et l'objet (par exemple un arbre).
si est la distance de l'image ; la distance entre l'objectif et l'endroit où l'image est formée
M est le grossissement ; quelle est la taille de l'image par rapport à l'objet. Pour les microscopes, nous souhaitons augmenter le grossissement.
Pour un didacticiel complet sur l'équation des lentilles fines, regardez cette vidéo de Khan Academia. Dans le gif ci-dessus, vous pouvez voir que la distance à laquelle l'objet se rapproche de l'objectif augmente la distance de l'image, ce qui augmente le grossissement. La ligne verticale avec deux flèches indique l'objectif.
