Salle de classe d'imagerie microscopique 丨 Application de la microscopie à fluorescence
La microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM) est une technique qui utilise l'onde évanescente générée par un faisceau lumineux se propageant entre deux milieux d'indice de réfraction différents pour sonder la surface de cellules vivantes marquées par fluorescence. En pratique, lorsqu'un faisceau laser incident rencontre l'interface entre la lamelle et le milieu aqueux contenant les cellules, il est réfléchi à l'angle critique (réflexion interne totale). Parce que l'énergie de l'onde évanescente diminue de façon exponentielle avec la distance de la lamelle, seuls les fluorophores à moins de 10 nanomètres de la surface (entre 10 et 200 nanomètres) sont excités par l'onde évanescente, tandis que les fluorophores plus éloignés sont largement non excités. Affecté. Ainsi, TIRFM entraîne des niveaux de signal élevés à partir de fluorophores situés près de la lamelle, superposés sur un fond très sombre, offrant un excellent rapport signal sur bruit. La limitation extrême de la profondeur d'excitation est idéale pour étudier les molécules simples ou la composition de la membrane et des organites dans les cellules adhérentes près de la surface de la lamelle (voir la figure 8 (e)). Étant donné que l'excitation est limitée aux régions minces près de la lamelle, le photoblanchiment et la phototoxicité sont également limités à ces régions, faisant de TIRFM l'une des méthodes les plus utiles pour l'observation à long terme. La technique est devenue un outil fondamental pour étudier un large éventail de phénomènes en biologie cellulaire et moléculaire.
La déconvolution est un algorithme appliqué à un ensemble d'images toutes focales acquises le long de l'axe optique (Z) pour améliorer le signal photonique dans une pile d'images pour un plan d'image donné ou plusieurs plans focaux. Les microscopes doivent être équipés de commandes de mise au point motorisées de haute précision pour garantir l'acquisition d'images à des intervalles précisément définis entre les plans focaux de l'échantillon. Dans une application typique (voir Fig. 8 (f)), le processus de déconvolution est utilisé pour flouter et supprimer la lumière hors foyer d'un plan focal donné en utilisant une excitation et une émission de fluorescence à champ large. L'application la plus complexe consiste à appliquer le processus de déconvolution à l'ensemble de la pile d'images pour générer des vues projetées ou des modèles 3D. Un ensemble d'images grand champ utilisées pour la déconvolution capture le nombre maximal théorique de photons émis par l'échantillon. Le processus de déconvolution redistribue les intensités "floues" des photons émis au-dessus et au-dessous du plan focal vers le plan d'origine. Ainsi, la déconvolution utilise presque toutes les intensités d'émission disponibles et fournit un budget lumineux optimal, faisant de cette technique la méthode de choix pour les échantillons très sensibles à la lumière.
Une variante du phénomène de transfert d'énergie par résonance sur la microscopie à fluorescence, la fluorescence ou le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) est utilisée pour obtenir des informations temporelles et spatiales quantitatives sur la liaison et l'interaction des protéines, des lipides, des enzymes et des acides nucléiques dans les cellules vivantes. FRET peut utiliser des techniques à état constant ou résolues dans le temps, mais l'imagerie FRET résolue dans le temps a l'avantage de cartographier plus précisément les distances donneur-accepteur. Un microscope à fluorescence large champ standard équipé de filtres d'excitation et d'émission appropriés et d'une caméra sensible peut être utilisé pour l'imagerie FRET. Les biocapteurs qui prennent en sandwich une protéine ou un peptide sensible à l'environnement entre deux protéines fluorescentes applicables au FRET sont actuellement largement utilisés en biologie cellulaire. Ces sondes sont facilement imagées sous microscopie à fluorescence à large champ en utilisant des techniques FRET à émission sensibilisée combinées à une analyse ratiométrique. De plus, l'imagerie spectrale et le démélange linéaire à l'aide de la microscopie confocale à balayage laser peuvent aider à surveiller les phénomènes de FRET dans les biocapteurs et d'autres applications de protéines fluorescentes.
La microscopie d'imagerie à durée de vie de fluorescence (FLIM) est une technique sophistiquée capable d'enregistrer simultanément la durée de vie de fluorescence et l'emplacement spatial d'un fluorophore à chaque emplacement de l'image. Cette méthode fournit un mécanisme pour étudier les paramètres environnementaux tels que le pH, la concentration ionique, la polarité du solvant, les interactions non covalentes, la viscosité et la tension d'oxygène dans des cellules vivantes uniques et présente les données dans des tableaux spatiaux et temporels. Les mesures FLIM des durées de vie de l'état excité à l'échelle de la nanoseconde sont indépendantes des concentrations locales de fluorophores, des effets de photoblanchiment et de la longueur du trajet (épaisseur de l'échantillon), mais sont sensibles aux réactions à l'état excité telles que le transfert d'énergie de résonance. En fait, combiner FLIM avec FRET en surveillant les changements de durée de vie des donneurs fluorescents avant et après le transfert d'énergie de résonance est considéré comme l'un des meilleurs moyens d'étudier ce phénomène.
La mobilité (coefficient de diffusion transversale) des macromolécules marquées par fluorescence et des petits fluorophores peut être déterminée par la technique de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Dans FRAP, une très petite zone sélectionnée (quelques micromètres de diamètre) est intensément éclairée, généralement avec un laser, pour produire un photoblanchiment complet du fluorophore dans cette zone. Le résultat est une réduction spectaculaire ou une annihilation de la fluorescence. Après une impulsion de photoblanchiment, le taux et l'étendue de la récupération de l'intensité de fluorescence dans les régions blanchies ont été surveillés en fonction du temps à de faibles intensités d'excitation pour générer des informations sur la cinétique du repeuplement et de la récupération des fluorophores (Figure 9). Le FRAP est généralement réalisé à l'aide d'EGFP ou d'autres protéines fluorescentes. Les techniques de photoactivation associées sont basées sur des fluorophores en cage synthétiques spéciaux ou des protéines fluorescentes fonctionnelles similaires qui peuvent être activées par de courtes impulsions d'UV ou de violet. La photoactivation et le FRAP peuvent être utilisés comme techniques complémentaires pour déterminer les paramètres de mobilité.
Dans une technique liée au FRAP, appelée perte de fluorescence après photoblanchiment (FLIP), une région fluorescente définie dans une cellule vivante subit un photoblanchiment répété par irradiation intense. Si tous les fluorophores étaient capables de diffuser dans la zone photoblanchie pendant la période de temps mesurée, cela entraînerait une perte complète du signal fluorescent dans toute la cellule. En calculant la vitesse à laquelle la fluorescence disparaît de la cellule entière, la mobilité diffusionnelle du fluorophore cible peut être déterminée. En outre, FLIP peut facilement identifier l'emplacement et la nature de toutes les barrières de diffusion entre les compartiments individuels des cellules, telles que la barrière entre le soma et l'axone d'un neurone.
La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), principalement utilisée en microscopie confocale à balayage laser ou en microscopie multiphotonique, est une méthode conçue pour déterminer des informations cinétiques telles que les taux de réaction chimique, les coefficients de diffusion, les techniques de poids moléculaire, le débit et l'agrégation. Dans le FCS, un petit volume (environ un femtomètre ; le foyer du laser limité par la diffraction) est éclairé par un faisceau laser focalisé pour enregistrer les fluctuations d'intensité d'autofluorescence induites par la dynamique des molécules fluorescentes en fonction du temps dans le volume occupé par les molécules fluorescentes. molécules (Fig. 10). Des fluorophores relativement petits diffusent rapidement dans le volume éclairé, produisant de courtes rafales d'intensité aléatoire. À l'inverse, des complexes plus grands (fluorophores liés à des macromolécules) se déplacent plus lentement, produisant des schémas d'intensité de fluorescence dépendant du temps plus longs et plus persistants.
Lorsque les structures marquées par fluorescence sont densément emballées et se chevauchent dans des régions spécifiques de cellules vivantes, leur dynamique et leur distribution spatiale sont difficiles à analyser. La microscopie ponctuelle à fluorescence (FSM) est une technique compatible avec presque toutes les modalités d'imagerie qui tire parti de très faibles concentrations de sous-unités marquées par fluorescence, réduit la fluorescence floue et améliore la visibilité des structures marquées et leur dynamique dans les régions épaisses. Les FSM sont mis en œuvre en étiquetant seulement une fraction de la structure entière d'intérêt. En ce sens, le FSM est similaire à l'exécution de FCS sur l'ensemble du champ de vision, bien qu'il mette davantage l'accent sur les modèles spatiaux plutôt que sur l'analyse temporelle quantitative. La microscopie par points fluorescents est particulièrement utile pour déterminer la mobilité et l'agrégation d'éléments du cytosquelette tels que l'actine et les microtubules dans les cellules hyperactives.
La microscopie à appauvrissement par émission stimulée (STED) est une technique émergente de super-résolution avec une résolution spatiale bien au-delà de la limite de diffraction, utilisant une lumière appauvrie en forme d'anneau pour entourer un plus petit faisceau de lumière d'excitation afin d'obtenir sous -50 nm sur l'axe à La résolution. La technique repose sur l'excitation de fluorophores avec des impulsions laser synchronisées et des impulsions STED circulaires spatialement coordonnées qui appauvrissent la lumière émise, supprimant la fluorescence des molécules excitées autour du foyer de balayage laser. La fluorescence générée à la périphérie du spot est supprimée, mais pas au centre du spot, ce qui réduit significativement la taille du spot fluorescent et augmente de manière significative la résolution. STED s'est avéré être un outil utile pour la détection à haute résolution des cellules vivantes. D'autres techniques émergentes de super-résolution, telles que la microscopie de localisation photoactivée (PALM) et la microscopie d'éclairage à lumière structurée (SIM), deviendront également des outils fondamentaux pour l'imagerie des cellules vivantes dans un avenir proche.
L'utilisation croissante de protéines fluorescentes codées génétiquement et de fluorophores synthétiques avancés pour l'imagerie des cellules vivantes ouvre la porte à de nouvelles modalités optiques pour surveiller la dynamique temporelle et les relations spatiales. Les microscopistes disposent désormais d'un ensemble complet d'outils pour observer et enregistrer les données d'image des processus cellulaires se produisant sur une large gamme d'échelles de temps et à plusieurs résolutions. Des événements plus lents peuvent être facilement observés et enregistrés à l'aide de la microscopie confocale à balayage laser, tandis que des événements cinétiques plus rapides peuvent être obtenus à l'aide de la technologie des disques rotatifs. De plus, la microscopie multiphotonique permet une imagerie profonde dans les tissus épais, et les techniques de réflexion interne totale permettent de sonder les surfaces membranaires avec une précision confocale. Des méthodes de fluorescence avancées, telles que FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM et STED, peuvent être utilisées pour surveiller les interactions protéine-protéine à des résolutions souvent meilleures que celles autorisées par la limite de diffraction. Avec les progrès de la technologie des fluorophores, des microscopes et des détecteurs, un monde plus vaste sera amené "sous le microscope".
