Imagerie par microscopie multiphotonique : diverses techniques d'imagerie des neurones in vivo
Par rapport au microscope à fluorescence grand champ à photon unique traditionnel, la microscopie multiphotonique (MPM) a les fonctions de sectionnement optique et d'imagerie profonde. En 2019, Jérôme Lecoq et al. ont discuté de la technologie MPM connexe sous trois aspects : l'imagerie neuronale profonde dans le cerveau, l'imagerie neuronale massive et l'imagerie neuronale à grande vitesse.
Afin de lier l'activité neuronale à un comportement complexe, il est généralement nécessaire d'imager les neurones dans le cortex profond, ce qui nécessite que le MPM ait la capacité d'imagerie profonde. La lumière d'excitation et d'émission sera fortement diffusée et absorbée par les tissus biologiques, ce qui est le principal facteur limitant la profondeur d'imagerie du MPM. Bien que le problème de diffusion puisse être résolu en augmentant l'intensité du laser, cela entraînera d'autres problèmes, tels que la combustion de l'échantillon, la défocalisation et l'excitation fluorescente près de la surface. La meilleure façon d'augmenter la profondeur de l'imagerie MPM est d'utiliser des longueurs d'onde plus longues comme lumière d'excitation.
De plus, pour l'imagerie à deux photons (2P), l'excitation de fluorescence floue et proche de la surface sont les deux principaux facteurs limitant la profondeur, tandis que pour l'imagerie à trois photons (3P), ces deux problèmes sont considérablement réduits, mais imagerie à trois photons due à la fluorescence La section efficace d'absorption du groupe est beaucoup plus petite que celle de 2P, donc une énergie d'impulsion d'un ordre de grandeur plus élevée est nécessaire pour obtenir le même signal de fluorescence d'intensité que celui excité par 2P. La microscopie 3P fonctionnelle est plus exigeante que la microscopie 3P structurelle, qui nécessite un balayage plus rapide afin d'échantillonner l'activité neuronale dans le temps ; une énergie d'impulsion plus élevée est nécessaire pour collecter suffisamment de signaux pendant le temps de séjour de chaque pixel.
Les comportements complexes impliquent souvent de grands réseaux cérébraux avec des connexions locales et à longue portée. Pour lier l'activité des neurones au comportement, il est nécessaire de surveiller en même temps l'activité de neurones très gros et largement distribués. Le réseau neuronal du cerveau traite les stimuli entrants en quelques dizaines de millisecondes. Pour comprendre ce réseau neuronal rapide Pour étudier la dynamique des neurones, MPM doit avoir la capacité d'imager rapidement les neurones. Les méthodes MPM rapides peuvent être divisées en techniques de balayage à faisceau unique et en techniques de balayage à faisceaux multiples.
La technologie de balayage à faisceau unique permet une traversée à grande vitesse du tissu neural avec un large champ de vision (FOV)
Lors de l'utilisation de MPM pour imager les neurones, le balayage à accès aléatoire, c'est-à-dire que le faisceau laser est rapidement balayé à n'importe quel point sélectionné sur l'ensemble du champ de vision, ne peut balayer que les neurones d'intérêt, ce qui évite non seulement de balayer les fibres nerveuses non marquées. optimiser également le temps de balayage du faisceau laser. Le balayage à accès aléatoire (Fig. 1) peut être réalisé avec un déflecteur acousto-optique (AOD), qui fonctionne en liant un transducteur piézoélectrique avec un signal radiofréquence à un cristal approprié. Les ondes acoustiques résultantes induisent un réseau d'indice de réfraction périodique. La diffraction se produit lorsqu'un faisceau laser traverse un réseau. L'intensité et la fréquence de l'onde sonore peuvent être ajustées par le signal électrique de radiofréquence pour modifier l'intensité et la direction de la lumière diffractée, de sorte qu'un balayage de point arbitraire horizontal unidimensionnel peut être réalisé en utilisant un AOD, et la 3D peut être réalisée en utilisant une paire d'AOD combinés avec d'autres technologies de balayage axial à accès aléatoire. Cependant, cette technique est très sensible au mouvement de l'échantillon et sujette aux artefacts de mouvement. À l'heure actuelle, le balayage raster rapide, c'est-à-dire le balayage progressif dans FOV, est largement utilisé car l'algorithme peut facilement résoudre les artefacts de mouvement.
Imagerie à deux photons basée sur l'AOD des neurones néocorticaux L2/3 in vivo[2]
Il existe de nombreuses façons de réaliser une numérisation raster rapide, en utilisant un miroir vibrant pour une numérisation 2D rapide, en combinant un miroir vibrant et une lentille électrique réglable pour une numérisation 3D rapide, mais la lentille électrique réglable ne peut pas se concentrer rapidement dans la direction axiale en raison de la limitation de inertie mécanique La commutation, qui affecte la vitesse d'imagerie, peut désormais être remplacée par un modulateur spatial de lumière (SLM).
La mise au point à distance est également un moyen d'obtenir une imagerie 3D, comme le montre la figure 2. Dans le module LSU, le galvanomètre à balayage balaye horizontalement, et le module ASU comprend l'objectif L1 et le miroir M, et le balayage axial est réalisé en ajustant la position de M. Cette technique permet non seulement de corriger l'aberration optique introduite par l'objectif principal L2, mais également de permettre un balayage axial rapide. Pour obtenir plus d'imagerie neuronale, le FOV peut être agrandi en ajustant la conception de l'objectif du microscope, mais l'objectif avec une grande NA et un grand FOV est généralement lourd et ne peut pas se déplacer rapidement pour un balayage axial rapide, de sorte que les grands systèmes FOV reposent sur Telefocus , SLM et objectifs motorisés réglables.
Schéma de principe d'un système d'imagerie à deux photons à focalisation à distance[3] La technologie de balayage multifaisceaux peut simultanément imager différentes positions du tissu neuronal
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm de distance) sites d'imagerie (Fig. 3C, D) ; pour les régions adjacentes, il utilise généralement plusieurs faisceaux d'une seule lentille d'objectif pour l'imagerie (Fig. 3E, F). La technique de balayage multifaisceaux doit accorder une attention particulière au problème de diaphonie entre les faisceaux d'excitation, qui peut être résolu par la méthode de séparation de la source lumineuse ou la méthode de multiplexage espace-temps. La méthode de séparation de source lumineuse post-hoc fait référence à l'utilisation d'algorithmes pour séparer les faisceaux afin d'éliminer la diaphonie ; la méthode de multiplexage espace-temps fait référence à l'utilisation simultanée de plusieurs faisceaux d'excitation, les impulsions de chaque faisceau sont retardées dans le temps, de sorte que les faisceaux individuels excités par différents faisceaux peuvent être temporairement séparés. signal fluorescent. Plus de neurones peuvent être imagés en introduisant plus de faisceaux, mais plusieurs faisceaux augmenteront le chevauchement du temps de décroissance de la fluorescence, ce qui limite la capacité de distinguer les sources de signal ; et le multiplexage a un impact négatif sur la vitesse de fonctionnement des appareils électroniques. Exigences élevées ; un grand nombre de faisceaux nécessite également une puissance laser plus élevée pour maintenir un rapport signal sur bruit approximatif d'un seul faisceau, ce qui peut facilement entraîner des lésions tissulaires.
Technologie d'imagerie à grande surface
Ces dernières années, le développement de différentes technologies MPM a élargi la portée de notre imagerie du tissu neural, nous permettant d'imager plus de neurones profondément dans le cerveau à une vitesse plus rapide, ce qui a grandement favorisé la recherche en neurosciences et nous a permis d'acquérir une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral.
