Principe et construction du microscope à fluorescence
Le microscope à fluorescence utilise une source de lumière ponctuelle à haute efficacité lumineuse, qui émet une certaine longueur d'onde de lumière (telle que la lumière ultraviolette de 3 650 pouces ou la lumière bleue violette de 4 200 pouces) à travers un système de filtrage des couleurs comme lumière d'excitation, et excite les substances fluorescentes dans l'échantillon pour émettent différentes couleurs de fluorescence. Ensuite, il est observé grâce au grossissement de l’objectif et de l’oculaire. De cette façon, même avec une faible fluorescence, il est facilement reconnaissable et très sensible sous des fonds fortement contrastés, principalement utilisés pour étudier la structure et la fonction cellulaire, ainsi que la composition chimique. La structure de base d'un microscope à fluorescence est composée d'un microscope optique ordinaire et de quelques accessoires (tels qu'une source de lumière fluorescente, un filtre d'excitation, un séparateur de faisceau bichromatique et un filtre de blocage, etc.). Sources de lumière fluorescente : utilisent généralement des lampes au mercure à ultra haute pression (50-200W), qui peuvent émettre de la lumière de différentes longueurs d'onde. Cependant, chaque substance fluorescente a une longueur d'onde de lumière d'excitation qui produit la fluorescence la plus forte, de sorte que des filtres d'excitation (généralement des filtres d'excitation ultraviolets, violets, bleus et verts) doivent être ajoutés pour permettre à seulement une certaine longueur d'onde de lumière d'excitation de passer à travers et d'éclairer. le spécimen, tout en absorbant toute autre lumière. Après avoir été irradiée par une lumière excitée, chaque substance émet une fluorescence visible avec une longueur d’onde plus longue que celle de l’irradiation sur une très courte période de temps. La fluorescence a une spécificité et est généralement plus faible que la lumière d'excitation. Afin d'observer une fluorescence spécifique, un filtre bloquant (ou supprimant) doit être ajouté derrière l'objectif. Il a deux fonctions : premièrement, il absorbe et bloque la lumière d'excitation de pénétrer dans l'oculaire pour éviter de perturber la fluorescence et d'endommager les yeux ; deuxièmement, il sélectionne et laisse passer une fluorescence spécifique, affichant une couleur de fluorescence spécifique. Les deux types de filtres doivent être sélectionnés pour être utilisés ensemble.
Il existe deux types de microscopes à fluorescence en fonction de leur chemin optique :
1. Microscope à fluorescence à transmission : la source de lumière d'excitation est transmise à travers le matériau de l'échantillon via un condenseur pour exciter la fluorescence. Les collecteurs de lumière en champ sombre couramment utilisés, ou les collecteurs de lumière ordinaires, peuvent être utilisés pour ajuster le réflecteur afin de convertir la lumière d'excitation et la lumière latérale sur l'échantillon. Il s’agit d’un microscope à fluorescence relativement ancien. Son avantage est que la fluorescence est forte à faible grossissement, tandis que son inconvénient est qu'elle s'affaiblit à mesure que le grossissement augmente. Il est donc préférable d’observer des échantillons de plus grande taille.
2. Microscope à fluorescence à faisceau tombant Il s'agit d'un nouveau type de microscope à fluorescence développé dans les temps modernes. Contrairement à la précédente, la lumière d'excitation tombe de la lentille d'objectif jusqu'à la surface de l'échantillon, en utilisant la même lentille d'objectif que le condenseur d'éclairage et la lentille d'objectif pour collecter la fluorescence. Un séparateur de faisceau bicolore doit être ajouté au chemin optique, qui forme un angle de 45 degrés par rapport à l'uranium léger. La lumière d'excitation est réfléchie dans la lentille de l'objectif et concentrée sur l'échantillon. La fluorescence générée par l'échantillon, ainsi que la lumière d'excitation réfléchie par la surface de la lentille d'objectif et du verre de protection, pénètrent simultanément dans la lentille d'objectif et retournent au séparateur de faisceau dichroïque, séparant l'excitation et la fluorescence. L'excitation résiduelle est ensuite absorbée par le filtre bloquant. Si différentes combinaisons de filtres d'excitation/séparateurs de faisceaux bicolores/filtres de blocage sont utilisées, ils peuvent répondre aux besoins de différents produits de réaction fluorescents. L'avantage de ce microscope à fluorescence est que le champ d'éclairage est uniforme, l'imagerie est claire et plus le grossissement est grand, plus la fluorescence est forte.
