Principes de la microscopie à fluorescence
Les microscopes à fluorescence sont différents des microscopes optiques ordinaires. Au lieu d'observer des spécimens sous l'éclairage de sources lumineuses ordinaires, ils utilisent la lumière d'une certaine longueur d'onde (généralement la lumière ultraviolette, la lumière bleu-violet) pour exciter les substances fluorescentes dans les spécimens sous le microscope afin de les faire émettre de la fluorescence. Par conséquent, la source lumineuse d'un microscope à fluorescence ne fonctionne pas comme un éclairage direct, mais comme une source d'énergie qui excite les substances fluorescentes à l'intérieur de l'échantillon. La raison pour laquelle nous pouvons observer l'échantillon est due à l'éclairage de la source lumineuse, mais le phénomène de fluorescence présenté après que la substance fluorescente dans l'échantillon absorbe l'énergie lumineuse excitée.
On peut voir que la caractéristique du microscope à fluorescence est que sa source lumineuse peut fournir une grande quantité de lumière d'excitation dans une plage de longueurs d'onde spécifique, de sorte que la substance fluorescente dans l'échantillon testé peut obtenir la lumière d'excitation de l'intensité nécessaire. En même temps, le microscope à fluorescence doit avoir le système de filtre correspondant.
La microscopie à fluorescence est un outil essentiel en histochimie par immunofluorescence. Il est composé d'une source de lumière ultra-haute tension, d'un système de filtre (y compris une plaque de filtre d'excitation et de suppression), d'un système optique et d'un système de photographie et d'autres composants principaux. Il utilise la lumière d'une certaine longueur d'onde pour exciter l'échantillon afin qu'il émette une fluorescence.
La manière d'exciter la fluorescence : selon la gamme de longueurs d'onde de la lumière, elle peut être divisée en deux types : la méthode d'excitation UV (utilisant la méthode d'éclairage ultraviolet) et la méthode d'excitation BV (utilisant la lumière bleu-violet). La méthode d'excitation UV utilise une lumière proche ultraviolette inférieure à 400 nm pour l'excitation. Il n'y a pas de lumière d'excitation visible dans cette méthode, de sorte que la fluorescence observée présente la fluorescence inhérente du colorant, et il est facile de distinguer la fluorescence spécifique sur l'échantillon de l'autofluorescence du tissu de fond.
La méthode d'excitation BV est basée sur 404 nm et 434 nm pour l'excitation de l'ultraviolet à la lumière bleue. Cette méthode utilise la lumière bleue pour irradier l'échantillon, de sorte que le filtre de coupure du système d'observation de la fluorescence doit utiliser un filtre qui peut complètement bloquer la lumière bleue et passer complètement la fluorescence verte et jaune requise. Colorants fluorescents pour les dosages d'anticorps fluorescents. La longueur d'onde d'absorption maximale de la lumière d'excitation est relativement proche de la longueur d'onde d'émission maximale de la fluorescence, de sorte que le filtre utilisé dans la méthode d'excitation BV doit utiliser un filtre à coupure nette. Cette méthode peut utiliser la lumière bleue comme lumière d'excitation, de sorte que l'efficacité d'absorption du pigment fluorescent est plus élevée et qu'une image plus lumineuse peut être obtenue. Son inconvénient est que la fluorescence inférieure à 500 nm ne peut pas être vue, et la fluorescence supérieure à 500 nm fait apparaître l'image entière en jaune. Dans la méthode des anticorps fluorescents, la spécificité du fluorochrome est souvent jugée par la couleur unique du fluorochrome. Par conséquent, lors de la discussion sur la spécificité subtile, les lacunes mentionnées ci-dessus de la méthode d'excitation BV ont souvent une grande influence.
En résumé, l'éclairement du microscope à fluorescence peut être considéré selon les trois points suivants selon la structure du condenseur et la longueur d'onde de la lumière d'excitation.
① Du point de vue des exigences de contraste de l'image fluorescente, le concentrateur de fond noir à excitation UV est utilisé pour l'éclairage.
② Compte tenu de la luminosité de l'image, le filtre d'excitation BV a la plus grande efficacité d'observation en champ sombre.
③Les caractéristiques de l'observation du champ sombre du filtre d'excitation UV et de l'éclairage du concentrateur de champ sombre d'excitation BV peuvent être considérées comme entre ces deux méthodes d'éclairage, mais la première a des propriétés de champ sombre plus fortes et affiche des images plus lumineuses. Le contraste est faible ; ce dernier conserve les propriétés du trajet lumineux en fond noir, de sorte que l'image affichée est plus sombre et le contraste est amélioré. Lors de l'utilisation réelle d'un microscope à fluorescence, la méthode d'éclairage qui convient le mieux aux exigences de l'échantillon doit être utilisée pour l'observation.
Il faut souligner que même si le condenseur de fond noir excité par UV avec le meilleur contraste est éclairé, une partie de la lumière d'excitation ultraviolette réfractée ou diffusée par l'échantillon entrera dans la lentille d'objectif. L'autofluorescence peut aggraver la réponse de l'image. Par conséquent, un filtre absorbant les UV doit être utilisé devant l'oculaire comme filtre de coupure.
