Exigences de préparation des échantillons pour la microscopie à fluorescence
Exigences relatives à la préparation d'échantillons pour la microscopie à fluorescence
(1) lame de verre
L'épaisseur de la lame de verre doit être comprise entre 0.8-L2 mm. Une lame trop épaisse absorbera plus de lumière d'une part et ne pourra pas focaliser la lumière d'excitation sur l'échantillon d'autre part. Les lames doivent être lisses, d'épaisseur uniforme et exemptes d'autofluorescence évidente. Parfois, des lames de quartz sont utilisées.
(2) Verre de protection
L'épaisseur du verre de protection est d'environ 0.17 mm, lisse. Afin de renforcer la lumière d'excitation, un verre de protection interférentiel peut également être utilisé, qui est un verre de protection spécial recouvert de plusieurs couches de substances (telles que le fluorure de magnésium) qui ont des effets d'interférence différents sur la lumière de différentes longueurs d'onde, ce qui peut rendre le fluorescence lisse. La lumière d'excitation est traversée et la lumière d'excitation est réfléchie, et cette lumière d'excitation réfléchie peut exciter l'échantillon.
(3) Spécimen
Les tranches de tissus ou autres spécimens ne doivent pas être trop épais. Si l'épaisseur est trop épaisse, la majeure partie de la lumière d'excitation sera consommée dans la partie inférieure de l'échantillon, tandis que la partie supérieure directement observée par l'objectif ne pourra pas être complètement excitée. De plus, la fluorescence causée par le chevauchement des cellules ou des impuretés, la coloration non spécifique de fond affecte le jugement.
(4) huile miroir
En règle générale, lors de l'observation d'échantillons avec des microscopes à fluorescence à fond noir et des microscopes à immersion dans l'huile, de l'huile à immersion doit être utilisée. Il est préférable d'utiliser une huile d'immersion spéciale non fluorescente. La glycérine peut également être utilisée à la place, et la paraffine liquide peut également être utilisée, mais l'indice de réfraction est faible, ce qui a un léger impact sur la qualité de l'image.
Comprendre le cube de lumière de la microscopie à fluorescence
La fluorescence est la lumière que les électrons d'une substance absorbent l'énergie lumineuse d'un état de basse énergie à un état de haute énergie, puis libèrent de la lumière lorsqu'elle revient à un état de basse énergie. Il s'agit d'une lumière rayonnée sans température, la luminescence. C'est-à-dire que la substance absorbe la lumière à ondes courtes, entre dans un état excité et émet de la lumière à ondes longues.
Qu'il s'agisse de l'autofluorescence de la substance, du colorant fluorescent ou de la protéine fluorescente exprimée par fusion, elle doit être excitée par une longueur d'onde lumineuse spécifique (excitation). Une fois que les électrons ont migré et perdu de l'énergie, ils émettent de la lumière d'une longue longueur d'onde spécifique (émission). , qui peuvent être collectées par le système de détection pour réaliser la fonction d'identification de fluorescence spécifique.
Qu'est-ce qu'un cube lumineux fluorescent ?
Dans l'observation et l'imagerie au microscope à fluorescence, la lumière d'excitation d'une longueur d'onde spécifique et la lumière d'émission à longue longueur d'onde correspondante sont fournies par le cube de lumière de fluorescence, de sorte que le signal de fluorescence peut être collecté à l'œil nu, sur un écran d'affichage ou par une caméra. Par conséquent, le cube lumineux de fluorescence détermine ce qui peut être détecté. Le dispositif clé du signal de fluorescence, ses caractéristiques comprennent EX : paramètres de filtre de longueur d'onde d'excitation, EM : paramètres de filtre de longueur d'onde d'émission et DM : paramètres de miroir dichotomique. Prenons l'exemple du cube lumineux DAPI du microscope à fluorescence intégré Revolve, EX : 385/30, EM : 450/50, DM : 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >La lumière de 425 nm peut être transmise à l'EM ; Les filtres d'émission EM sont utilisés pour séparer la fluorescence émise par le fluorophore des autres éléments optiques de fond pour séparer la lumière. Les filtres d'émission transmettent la lumière à la longueur d'onde de fluorescence à travers le miroir dichroïque tout en bloquant toute autre lumière qui fuit de la source de lumière d'excitation (réfléchie par l'échantillon ou l'optique). La longueur d'onde de la lumière émise est supérieure à l'EM à observer, c'est-à-dire que seule la lumière dans la plage de 450 ± 25 nm pénètre dans le système de détection. Une sélection appropriée des filtres EX, EM et des dichotomies DM peut aider les chercheurs à obtenir des rapports signal/bruit (S/N) plus élevés.
