Techniques de coloration et observation microscopique des micro-organismes
Coloration simple des bactéries
1 Objectifs
1.1 Apprendre les techniques de base du frottis microbien et de la coloration.
1.2 Maîtriser la méthode simple de coloration des bactéries.
1.3 Connaître les caractéristiques morphologiques des bactéries, et consolider l'apprentissage de l'utilisation du miroir à huile et des techniques de fonctionnement aseptique.
2 Principe Le frottis et la coloration des bactéries constituent une technique de base dans les expériences de microbiologie. Les cellules des bactéries sont petites et transparentes, elles ne sont pas faciles à reconnaître au microscope optique ordinaire et doivent être colorées. L'utilisation d'un seul colorant pour colorer les bactéries, de sorte que l'organisme coloré et l'arrière-plan forment une différence de couleur claire, afin que leur morphologie et leur structure puissent être plus clairement observées. Cette méthode est facile à réaliser et convient à l’observation de la forme générale de l’organisme et de la disposition des bactéries. Les colorants alcalins sont couramment utilisés pour une coloration simple, car dans les solutions neutres, alcalines ou faiblement acides, les cellules bactériennes sont généralement chargées négativement, et lorsque les colorants alcalins sont ionisés, la partie colorante de leurs molécules est chargée positivement, donc la partie colorante des colorants alcalins. peut facilement se lier aux bactéries pour les colorer. Les cellules bactériennes colorées contrastent fortement avec le fond et sont plus faciles à reconnaître au microscope. Les colorants couramment utilisés pour la coloration simple comprennent le bleu de mérocyanine, le violet cristallin et le rouge composé basique. Lorsque la décomposition bactérienne du sucre produit de l'acide, de sorte que le pH du milieu diminue, la charge positive de la bactérie augmente et peut ensuite être utilisée en rouge, en rouge acide ou en rouge Congo et dans d'autres colorants acides. Les bactéries doivent être fixées avant la coloration. Son objectif est double : l’un est de tuer les bactéries et de les faire adhérer à la lame ; la seconde consiste à augmenter son affinité pour le colorant. Deux méthodes sont couramment utilisées : le chauffage et la fixation chimique. Essayez de conserver la morphologie originale des cellules lors de la fixation.
3 matériaux
3.1 Souche Bacillus subtilis 12-18h culture inclinée sur gélose nutritive, Staphylococcus aureus environ 24h de culture inclinée sur gélose nutritive, Escherichia coli 24h de culture inclinée sur gélose nutritive, culture inclinée sur gélose de levure de boulanger.
3.2 Coloration au bleu de méthylène alcalin de Lue (ou coloration au violet cristallin d'oxalate d'ammonium), coloration rouge composée d'acide carbolique.
3.3 Instruments ou autres accessoires Microscope, lampe à alcool, lame, anneau d'inoculation, porte-lame, bouteille double couche (remplie d'huile de cèdre et de xylène), papier pour microscope, sérum physiologique ou eau distillée, etc.
4 Procédure Frottis → séchage → fixation → coloration → lavage → séchage → examen microscopique.
5 étapes
5.1 frottis Prélever deux lames propres et exemptes d'huile, chacune avec une petite goutte de solution saline (ou d'eau distillée) au centre de la lame dans des conditions aseptiques, avec un anneau d'inoculation pour opérer de manière aseptique, respectivement, à partir du Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus et Escherichia coli inclinés pour cueillir un peu de mousse dans la goutte d'eau, en mélangeant et en enrobant d'un film. Si la suspension bactérienne (ou la culture liquide) s'étale, on peut utiliser l'anneau pour inoculer 2 à 3 anneaux directement sur la lame. Notez que la solution saline (eau distillée) et les bactéries ne doivent pas être trop nombreuses et réparties uniformément, pas trop épaisses.
5.2 Séchage Sécher naturellement à température ambiante. Il peut également être séché en chauffant légèrement au-dessus d'une lampe à alcool avec la face enduite vers le haut. Cependant, ne vous approchez pas trop de la flamme, car une température trop élevée détruirait la morphologie des bactéries.
5.3 Fixation Si un séchage thermique est utilisé, la fixation et le séchage sont combinés en une seule étape de la même manière que le séchage. Enduire, sécher et fixer à chaud.
5.4 Coloration Placez la lame à plat sur le support pour lames, ajoutez 1 à 2 gouttes de solution de coloration sur le frottis (la solution de coloration recouvre juste le film du frottis). Colorer le frottis avec le Basic Mellanox Blue de Lü pendant 1 à 2 minutes et avec le Carbonate Red (ou l'Ammonium Oxalate Crystal Violet) pendant environ 1 minute.
5.5 Rinçage Versez la solution de coloration et rincez doucement à l'eau du robinet depuis une extrémité de la lame jusqu'à ce que l'eau qui s'écoule du frottis soit incolore. Lors du rinçage, ne laissez pas l'eau couler directement pour laver la surface enduite. Le débit d'eau ne doit pas être trop rapide ni trop important pour éviter de déloger le film de frottis.
5.6 Séchage Secouez les gouttelettes d'eau sur la lame pour sécher naturellement, séchez-les ou utilisez du papier absorbant pour absorber le sec (veillez à ne pas essuyer le corps bactérien). 5.7 Examen microscopique Le frottis est séché et examiné au microscope. Le frottis doit être complètement sec avant de pouvoir être observé au microscope à huile.
6 Résultats Dessiner la morphologie d'E. coli et de Micrococcus garciniae après coloration unique.
Coloration de Gram
1 Objectif
1.1 Comprendre le principe de la coloration de Gram et son importance dans la classification et l'identification des bactéries.
1.2 Apprendre et maîtriser la technique de coloration de Gram et consolider l'apprentissage de l'utilisation de la lentille à huile du microscope optique.
