Pourquoi dois-je utiliser un microscope confocal ?
1. Le microscope optique a été perfectionné grâce aux efforts et aux améliorations de nos grands prédécesseurs. En fait, le microscope habituel peut nous fournir facilement et rapidement de belles images microscopiques. Cependant, l'événement qui a révolutionné le monde des microscopes presque parfaits a été l'invention du « microscope confocal à balayage laser ». Ce nouveau type de microscope se caractérise par un système optique qui extrait les informations d'image uniquement de la surface sur laquelle la mise au point est concentrée, et en changeant la mise au point tout en récupérant les informations acquises dans la mémoire d'image, il est possible d'obtenir une image nette avec informations 3-dimensionnelles complètes. De cette manière, il est possible d’obtenir facilement des informations sur la forme de la surface qui ne peuvent pas être confirmées avec un microscope conventionnel. De plus, alors que « l'augmentation de la résolution » et « l'approfondissement de la profondeur de champ » sont des conditions contradictoires pour les microscopes optiques conventionnels, en particulier à fort grossissement, ce problème est résolu avec les microscopes confocaux.
2. Avantages du système optique confocal
Diagramme schématique du microscope confocal laser
Le système optique confocal est un éclairage ponctuel de l'échantillon, tandis que la lumière réfléchie est également reçue à l'aide d'un récepteur ponctuel. Lorsque l'échantillon est placé au point focal, presque toute la lumière réfléchie atteint le photorécepteur, et lorsque l'échantillon est flou, la lumière réfléchie ne peut pas atteindre le photorécepteur. En d’autres termes, dans un système optique confocal, seule l’image qui coïncide avec le point focal est émise, et les taches et la lumière dispersée inutile sont bloquées.
3. Pourquoi utiliser un laser ?
Dans un système optique confocal, l'échantillon est éclairé en un point et la lumière réfléchie est reçue par un capteur ponctuel. Une source lumineuse ponctuelle est donc nécessaire. Les lasers sont essentiellement une source de lumière ponctuelle. Dans la plupart des cas, la source de lumière des microscopes confocaux est une source de lumière laser. De plus, la monochromaticité, la directivité et l’excellente forme du faisceau des lasers sont des raisons importantes de leur adoption généralisée.
4. Une observation en temps réel basée sur un balayage à grande vitesse est possible.
Pour le balayage laser, une unité de déflexion optique acoustique (Acoustic Optical Deflector, AO prime) est utilisée dans la direction horizontale, et un miroir de balayage à faisceau contrôlé par servoélectronique (Servo Galvano-mirror) est utilisé dans la direction verticale. Puisqu'il n'y a pas de vibration mécanique dans le déflecteur AO, un balayage à grande vitesse est possible et une observation en temps réel sur l'écran du moniteur est possible. La vitesse élevée de cette caméra est un élément très important qui affecte directement la vitesse de mise au point et de récupération de position.
5. Relation entre la position de mise au point et la luminosité
Dans un système optique confocal, l'échantillon est placé correctement en position focale lorsque la luminosité est trop grande, devant et derrière lui, sa luminosité sera fortement réduite (figure 4 en trait plein). Cette sélectivité sensible du plan focal est le principe derrière l’orientation en hauteur du microscope confocal et l’expansion de la profondeur de focalisation. En revanche, les microscopes optiques habituels ne montrent aucun changement significatif de luminosité avant et après la position focale (ligne pointillée sur la figure 4).
6. Contraste élevé, haute résolution
Dans un microscope optique conventionnel, la lumière réfléchie par la partie floue du microscope interfère et chevauche la partie d'imagerie focale du microscope, entraînant une diminution du contraste de l'image. En revanche, dans un système optique confocal, la lumière diffusée à l’extérieur du point focal et à l’intérieur de l’objectif est presque complètement supprimée, ce qui donne des images avec un contraste très élevé. De plus, le pouvoir de résolution du microscope est amélioré car la lumière traverse deux fois l'objectif, ce qui rend l'image ponctuelle plus nette.
7. Fonction de localisation optique
Dans le système optique confocal, la lumière réfléchie est protégée par la micro-ouverture au point autre que le point focal. En conséquence, lors de l'observation d'un échantillon tridimensionnel, l'image est formée comme si l'échantillon avait été découpé avec le point focal (Fig. 5). Cet effet est appelé localisation optique et constitue l’une des caractéristiques des systèmes optiques confocaux.
