La microscopie à fluorescence diffère de la microscopie conventionnelle
Les microscopes à fluorescence utilisent la lumière ultraviolette comme source de lumière pour irradier l'objet à inspecter, afin que l'objet émette de la lumière, puis observez l'objet au microscope. Il est principalement utilisé pour les cellules d’immunofluorescence. Il est principalement composé d'une source de lumière, d'un système de plaque filtrante et d'un système optique pour observer l'image fluorescente de l'échantillon grâce au grossissement de l'oculaire et de l'objectif. Jetons un coup d'œil à la différence entre ce microscope à fluorescence et un microscope optique ordinaire.
1. Regardez la méthode d'éclairage
La méthode d'éclairage du microscope à fluorescence est généralement épiscopique, c'est-à-dire que la source lumineuse est projetée sur l'échantillon à tester à travers l'objectif.
2. Regardez la résolution
Les microscopes à fluorescence utilisent la lumière ultraviolette comme source de lumière et la longueur d'onde est relativement courte, mais la résolution est supérieure à celle des microscopes optiques ordinaires.
3. La différence dans le filtre
Les microscopes à fluorescence utilisent deux filtres spéciaux, utilisés devant la source de lumière pour filtrer la lumière visible, et utilisés entre l'objectif et l'oculaire pour filtrer les rayons ultraviolets, ce qui peut protéger les yeux humains.
Le microscope à fluorescence est également une sorte de microscope optique, principalement parce que la longueur d'onde excitée par le microscope à fluorescence est courte, ce qui entraîne une différence de structure et d'utilisation entre le microscope à fluorescence et le microscope ordinaire. La plupart des microscopes à fluorescence ont une bonne fonction de capture de lumière faible, donc sous une fluorescence extrêmement faible, leur capacité d'imagerie est également bonne. Couplé à l'amélioration continue des microscopes à fluorescence ces dernières années, le bruit a également été considérablement réduit. C’est pourquoi de plus en plus de microscopes à fluorescence sont utilisés.
paire
Connaissance de la microscopie à fluorescence photonique
Le principe de base de l'excitation à deux photons est le suivant : dans le cas d'une densité photonique élevée, les molécules fluorescentes peuvent absorber deux photons de grande longueur d'onde en même temps et émettre un photon de longueur d'onde plus courte après une courte durée de vie dite excitée ; l'effet est le même que celui de l'utilisation d'un photon avec une longueur d'onde moitié de la longueur d'onde longue pour exciter des molécules fluorescentes. L'excitation à deux photons nécessite une densité photonique élevée. Afin de ne pas endommager les cellules, la microscopie à deux photons utilise des lasers pulsés à mode verrouillé de haute énergie. Le laser émis par ce laser a une énergie de crête élevée et une énergie moyenne faible, sa largeur d'impulsion n'est que de 100 femtosecondes et sa fréquence peut atteindre 80 à 100 mégahertz. Lorsque vous utilisez un objectif à haute ouverture numérique pour focaliser les photons du laser pulsé, la densité de photons au point focal de l'objectif est la plus élevée et l'excitation à deux photons ne se produit qu'au point focal de l'objectif. Le microscope à deux photons ne nécessite pas de sténopé confocal, ce qui améliore l'efficacité de la détection de fluorescence.
Dans les phénomènes généraux de fluorescence, en raison de la faible densité de photons de la lumière d'excitation, une molécule fluorescente ne peut absorber qu'un seul photon en même temps, puis émettre un photon fluorescent via une transition radiative, qui est une fluorescence à photon unique. Pour le processus d’excitation de fluorescence utilisant le laser comme source de lumière, une fluorescence à deux photons ou même à plusieurs photons peut se produire. À ce stade, l'intensité de la source lumineuse d'excitation utilisée est élevée et la densité de photons répond aux exigences des molécules fluorescentes absorbant deux photons en même temps. Lors de l'utilisation d'un laser général comme source de lumière d'excitation, la densité de photons n'est toujours pas suffisante pour produire le phénomène d'absorption à deux photons. Habituellement, un laser pulsé femtoseconde est utilisé et sa puissance instantanée peut atteindre l'ordre du mégawatt. Par conséquent, la longueur d’onde de la fluorescence à deux photons est plus courte que la longueur d’onde de la lumière d’excitation, ce qui équivaut à l’effet produit par l’excitation à la moitié de la longueur d’onde d’excitation.
La microscopie à fluorescence biphotonique présente de nombreux avantages :
1) La lumière à longueur d’onde longue est moins affectée par la diffusion que la lumière à longueur d’onde courte et pénètre facilement dans l’échantillon ;
2) Les molécules fluorescentes en dehors du plan focal ne sont pas excitées, de sorte qu'une plus grande quantité de lumière d'excitation puisse atteindre le plan focal, de sorte que la lumière d'excitation puisse pénétrer des échantillons plus profonds ;
3) La lumière proche infrarouge à grande longueur d’onde est moins toxique pour les cellules que la lumière à courte longueur d’onde ;
4) Lors de l'utilisation d'un microscope à deux photons pour observer des spécimens, le photoblanchiment et la phototoxicité se produisent uniquement dans le plan focal. Par conséquent, la microscopie à deux photons est plus adaptée que la microscopie à photon unique pour observer des spécimens épais, pour observer des cellules vivantes ou pour des expériences de photoblanchiment ponctuel.
Connaissance de la microscopie confocale à fluorescence
Le principe de base de la microscopie confocale à fluorescence : l'échantillon est irradié par une source lumineuse ponctuelle et une petite tache lumineuse bien définie est formée sur le plan focal. Une fois le point irradié, la fluorescence émise est collectée par la lentille de l'objectif et renvoyée au séparateur de faisceau composé d'un miroir dichroïque le long du trajet d'éclairage d'origine. Le séparateur de faisceau envoie la fluorescence directement au détecteur. Il y a un sténopé devant la source lumineuse et le détecteur, appelés respectivement sténopé d'éclairage et sténopé de détection. La taille géométrique des deux est la même, environ 100-200 nm ; par rapport à la tache lumineuse sur le plan focal, les deux sont conjugués, c'est-à-dire que la tache lumineuse passe à travers une série de lentilles et peut finalement être focalisée sur le sténopé d'éclairage et le sténopé de détection en même temps. De cette manière, la lumière provenant du plan focal peut converger dans la portée du trou de détection, tandis que la lumière diffusée au-dessus ou au-dessous du plan focal est bloquée à l'extérieur du trou de détection et ne peut pas être imagée. Le laser scanne l'échantillon point par point, et le tube photomultiplicateur après avoir détecté le trou d'épingle obtient également l'image confocale de la lumière correspondante point par point, qui est convertie en signal numérique et transmise à l'ordinateur, et finalement agrégée en un signal clair. image confocale de tout le plan focal sur l'écran.
Chaque image du plan focal est en fait une section transversale optique de l'échantillon, et cette section transversale optique a toujours une certaine épaisseur, également appelée section mince optique. Étant donné que l'intensité lumineuse au point focal est beaucoup plus grande que celle au point non focal et que la lumière du plan non focal est filtrée par le sténopé, la profondeur de champ du système confocal est approximativement nulle et le balayage le long du L'axe Z peut réaliser une tomographie optique, formant une tranche optique bidimensionnelle au point focalisé de l'échantillon à observer. En combinant le balayage du plan XY (plan focal) avec le balayage de l'axe Z (axe optique), l'image tridimensionnelle de l'échantillon peut être obtenue en accumulant des images bidimensionnelles de couches continues et traitées par un logiciel informatique spécial.
Autrement dit, le sténopé de détection et le sténopé de la source lumineuse sont toujours focalisés sur le même point, de sorte que la fluorescence excitée en dehors du plan focal ne peut pas pénétrer dans le sténopé de détection.
L’expression simple du principe de fonctionnement du laser confocal est qu’il utilise la lumière laser comme source de lumière. Sur la base de l'imagerie traditionnelle au microscope à fluorescence, il ajoute un dispositif de balayage laser et un dispositif de focalisation conjugué, et il s'agit d'un système d'acquisition et de traitement d'images numériques via un contrôle informatique.
