Méthodes d'extension de la profondeur focale des microscopes multiphotoniques
La combinaison d'un microscope à balayage laser à deux -photons et d'un indicateur de calcium constitue la référence en matière de détection de signaux neuronaux in vivo. Les neurones des réseaux neuronaux sont répartis dans un espace tridimensionnel-, et la surveillance de la dynamique de leur activité nécessite un moyen d'améliorer rapidement le taux d'imagerie volumique. Cependant, en utilisant un microscope multiphotonique à balayage à réseau pour imager un grand nombre d'images, si un objectif à ouverture numérique (NA) élevée est utilisé pour obtenir une résolution latérale plus élevée, cela entraînera une profondeur focale plus petite. Afin d'obtenir une imagerie volumique à une faible profondeur focale,
Il est nécessaire d'effectuer un balayage sur l'axe Z- par certains moyens, en imaginant de nombreux plans en balayant chaque plan focal, ce qui limite considérablement la vitesse d'imagerie. Si les informations de l'image axiale peuvent être sacrifiées et qu'un balayage volumique peut être réalisé en un seul balayage latéral en étendant la profondeur de champ, c'est-à-dire que les informations volumiques sont projetées sur une seule image 2D, la vitesse d'imagerie peut être considérablement améliorée. C'est ce qu'on appelle l'imagerie à profondeur de focalisation étendue (EDF), qui est particulièrement utile pour imager des structures de population clairsemées qui nécessitent une résolution temporelle élevée, comme l'imagerie fonctionnelle de l'activité neuronale.
Les résolutions axiale et latérale d'un microscope sont déterminées par l'ouverture numérique (NA) de l'objectif. Une NA élevée peut maximiser la résolution axiale et latérale ainsi que la quantité de lumière collectée ; Une NA inférieure entraînera une résolution axiale plus faible, c'est-à-dire une profondeur de champ plus longue, mais sacrifiera en même temps la résolution latérale et l'efficacité de la collecte de la lumière. La méthode d’extension de la profondeur de champ qui sera présentée ensuite peut y parvenir tout en conservant une résolution latérale élevée et un flux lumineux suffisant.
L'utilisation de modulateurs spatiaux de lumière pour générer des faisceaux de Bessel fins et focaux peut permettre d'obtenir une imagerie EDF, mais les modulateurs spatiaux de lumière sont encombrants et difficiles à être compatibles avec des espaces de microscope étroits ; En revanche, les modules de Bessel basés sur des pyramides axiales sont bon marché et compacts, mais ils ne peuvent générer que des points focaux de profondeur fixe et ne conviennent pas à diverses expériences nécessitant des changements continus de profondeur focale. Pour résoudre ce problème, en 2018, RONGWEN LU et al. a démontré un module Bessel basé sur un axicon, dans lequel une seule lentille doit être translatée le long de l'axe optique pour ajuster en continu la longueur axiale du point focal de Bessel.
Figure 1 (a) Schéma du dispositif du module Bessel ; (b) La fonction d'étalement des points a été mesurée expérimentalement lorsque D était respectivement de -12 mm, 0 mm et 12 mm ; (c) La relation entre la pleine largeur latérale à mi-hauteur, (d) la pleine largeur axiale à mi-hauteur, (e) le signal de crête et (f) la puissance optique derrière l'objectif avec un déplacement L2 D
Le dispositif modulaire permettant de former un point focal de Bessel de longueur variable est illustré à la figure 1a. Le faisceau gaussien incident est façonné en un faisceau circulaire après avoir traversé un axicon et une lentille L1. Le masque d'ouverture circulaire ultérieur peut bloquer la lumière parasite provoquée par des défauts d'axicon, façonnant ainsi la distribution axiale de la fonction d'étalement des points d'excitation à deux photons -. Ensuite, le faisceau lumineux est projeté sur le galvanomètre par les lentilles L2 et L3, puis atteint le plan focal arrière de l'objectif à travers les lentilles L4 et L5.
Ces conceptions sont similaires aux modules pyramidaux traditionnels, à la différence qu'en déplaçant L2 ou L3 le long de l'axe optique, la longueur axiale du foyer de Bessel peut être ajustée en continu. La figure 1b montre les fonctions d'étalement des points axiaux pour les valeurs D de - 12 mm, 0 mm et 12 mm, avec une largeur axiale totale à mi-hauteur de 39 ? moi, 24 ans ? M et 14 ? m. Comme le montrent les figures 1c à f, le déplacement de l'objectif L2 de gauche à droite peut modifier en continu la largeur totale à mi-hauteur dans les directions transversale et axiale, ce qui signifie que la profondeur de champ peut être modifiée en continu. Les résultats de simulation numérique basés sur la théorie de la diffraction vectorielle sont en bon accord avec les données expérimentales. La figure 2 vérifie l'effet de correction de différentes tailles de masques annulaires sur les défauts d'axicon. Il s’avère que des masques annulaires plus fins peuvent mieux optimiser la distribution axiale de l’intensité du faisceau de Bessel de sortie, mais en même temps, ils entraînent également une perte de puissance plus importante.
