La principale méthode d'observation du microscope optique est l'observation par fluorescence
Phénomène de fluorescence
La fluorescence fait référence au processus par lequel une substance fluorescente émet de la lumière avec une longueur d'onde plus longue presque simultanément lorsqu'elle est irradiée avec une lumière d'une longueur d'onde spécifique (Figure 1). Lorsque la lumière d'une longueur d'onde spécifique (longueur d'onde d'excitation) frappe une molécule (comme une molécule dans un fluorophore), l'énergie des photons est absorbée par les électrons de la molécule. Ensuite, les électrons passent de l'état fondamental (S0) à un niveau d'énergie supérieur, l'état excité (S1'). Ce processus est appelé excitation①. L'électron reste dans l'état excité pendant 10-9–10-8 secondes, pendant lesquelles l'électron perd de l'énergie ②. Lors du processus de sortie de l'état excité (S1) et de retour à l'état fondamental ③, l'énergie restante absorbée pendant le processus d'excitation sera libérée.
Le temps de séjour d'une molécule fluorescente à l'état excité est la durée de vie de fluorescence, généralement en nanosecondes, qui est une caractéristique inhérente à la molécule fluorescente elle-même. La technologie d'imagerie utilisant la durée de vie de la fluorescence s'appelle Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), qui peut effectuer des mesures fonctionnelles et précises plus approfondies en plus de l'imagerie d'intensité de fluorescence pour obtenir la conformation moléculaire, les interactions intermoléculaires et les microenvironnements moléculaires. informations difficiles à obtenir avec l'imagerie optique conventionnelle.
Une autre propriété importante de la fluorescence est le décalage de Stokes, la différence de longueur d'onde entre les pics d'excitation et d'émission (Figure 2). Habituellement, la longueur d'onde de la lumière d'émission est plus longue que la longueur d'onde de la lumière d'excitation. En effet, après l'excitation de la substance fluorescente et avant la libération du photon, les électrons perdront une partie de l'énergie par le processus de relaxation. Les substances fluorescentes avec des décalages de Stokes plus importants sont plus faciles à observer sous un microscope à fluorescence.
Microscopes à fluorescence et blocs filtrants à fluorescence
La microscopie à fluorescence est un microscope optique qui utilise les propriétés de fluorescence pour observer et imager, et est largement utilisée dans la biologie cellulaire, la neurobiologie, la botanique, la microbiologie, la pathologie, la génétique et d'autres domaines. L'imagerie par fluorescence présente les avantages d'une sensibilité et d'une spécificité élevées, et est très appropriée pour l'observation de la distribution de protéines spécifiques, d'organites, etc. dans les tissus et les cellules, l'étude de la co-localisation et de l'interaction, et le suivi de la dynamique de la vie processus tels que les changements de concentration en ions.
La plupart des molécules dans les cellules ne sont pas fluorescentes et, pour les voir, elles doivent être marquées par fluorescence. Il existe de nombreuses méthodes de marquage fluorescent, qui peuvent être directement marquées (comme l'utilisation de DAPI pour marquer l'ADN), ou l'immunomarquage utilisant les propriétés de liaison à l'antigène des anticorps, ou la protéine cible peut être marquée avec des protéines fluorescentes (telles que GFP, vert protéine fluorescente), ou liaison réversible. colorants synthétiques (tels que Fura-2), etc.
À l'heure actuelle, le microscope à fluorescence est devenu l'équipement d'imagerie standard de divers laboratoires et plates-formes d'imagerie, et c'est une bonne aide pour nos expériences quotidiennes. Les microscopes à fluorescence sont principalement divisés en trois catégories : les microscopes à fluorescence droits (adaptés à la coupe), les microscopes à fluorescence inversés (adaptés aux cellules vivantes, en tenant compte des coupes), les microscopes stéréoscopiques à fluorescence (adaptés aux spécimens plus grands, tels que les plantes, les poissons zèbres (adultes/ embryon), médaka, organes de souris/rat, etc.).
Le bloc de filtre de fluorescence est le composant central de l'imagerie de fluorescence dans les microscopes. Il se compose d'un filtre d'excitation, d'un filtre d'émission et d'un séparateur de faisceau dichroïque. Il est installé dans la roue à filtres, comme le Leica DMi8 équipé d'une roue à filtres en position 6- (Figure 3). ). Différents microscopes ont des positions de roue différentes, et certains microscopes utilisent des lames porte-filtre.
Le bloc filtre joue un rôle important dans l'imagerie de fluorescence : le filtre d'excitation sélectionne la lumière d'excitation pour exciter l'échantillon et bloque les autres longueurs d'onde de lumière ; la lumière traversant le filtre d'excitation passe à travers une lame séparatrice dichroïque (son rôle est de réfléchir la lumière d'excitation et de transmettre la fluorescence), Après réflexion, elle est focalisée par l'objectif, irradiée vers l'échantillon, et la fluorescence correspondante est excitée vers émettre de la lumière. La lumière émise est collectée par la lentille d'objectif, passe à travers le séparateur de faisceau dichroïque et atteint le filtre d'émission. Comme le montre la figure 4 : la longueur d'onde d'excitation est de 450-490 nm, le séparateur de faisceau dichroïque réfléchit la lumière inférieure à 510 nm, transmet la lumière supérieure à 510 nm et la plage de réception de la lumière d'émission est de 520-560 nm.
Les filtres à fluorescence couramment utilisés dans les microscopes à fluorescence peuvent être divisés en deux types : passe-long (LP en abrégé) et passe-bande (BP en abrégé). La bande passante est généralement déterminée par la longueur d'onde centrale et la largeur de l'intervalle, par exemple 480/40, ce qui signifie que la lumière de 460-500 nm peut être transmise. Les filtres passe-haut, tels que 515 LP, laissent passer la lumière avec des longueurs d'onde supérieures à 515 nm (Figure 5).
Les substances fluorescentes ont leur courbe d'excitation (absorption) et leur courbe d'émission caractéristiques, le pic d'excitation est la longueur d'onde d'excitation idéale (efficacité d'excitation élevée, qui peut réduire l'énergie lumineuse d'excitation, protéger les cellules et les colorants), et la courbe d'émission est la longueur d'onde de fluorescence d'émission intervalle. Par conséquent, dans l'expérience, nous choisirons la longueur d'onde aussi proche que possible du pic d'excitation pour l'excitation, et la plage de réception doit inclure le pic d'émission. Par exemple, le pic d'excitation d'Alexa Fluor 488 est de 500 nm et le filtre d'excitation de 480/40 peut être sélectionné dans le microscope à fluorescence.
Les détails des cubes de filtre peuvent être visualisés dans le logiciel d'imagerie au microscope. Comprendre les colorants et trouver le filtre qui correspond le mieux à votre échantillon est essentiel pour l'imagerie par fluorescence. Les informations spectrales des colorants fluorescents et des protéines fluorescentes sont généralement indiquées dans les instructions et peuvent également être trouvées en ligne.
En plus des longueurs d'onde d'excitation et d'émission des sondes fluorescentes, la sélection des blocs de filtre doit également tenir compte de l'existence d'une excitation non spécifique et de l'existence d'une couleur croisée pour les échantillons marqués multicolores. De plus, il faut tenir compte de la source de lumière fluorescente utilisée. À l'heure actuelle, les sources lumineuses fluorescentes couramment utilisées comprennent les lampes au mercure, les lampes aux halogénures métalliques et les sources lumineuses à LED qui se sont développées rapidement ces dernières années. Le spectre d'une source de lumière fluorescente est continu ou discontinu, et l'énergie sera différente dans différentes bandes de longueur d'onde. La source de lumière LED devient progressivement la principale source de lumière du microscope à fluorescence en raison de sa bande spectrale relativement étroite, de sa production d'énergie plus stable, de sa longue durée de vie, de sa sécurité et de sa protection de l'environnement et de nombreux autres avantages.
En plus du bloc de filtre intégré du microscope, il existe également une roue rapide externe (Figure 7). La vitesse de conversion du filtre adjacent à la roue rapide externe de Leica est de 27 ms, ce qui permet de réaliser des expériences multicolores à grande vitesse, telles que l'imagerie calcique FRET et Fura2 ratio. (Fig. 8) et al.
Une grande variété de techniques d'imagerie par microscopie à fluorescence
Afin de répondre aux différents besoins d'imagerie de fluorescence, en complément des microscopes à fluorescence, différentes solutions d'imagerie par microscopie de fluorescence ont été développées :
Les systèmes d'imagerie haute définition à grand champ, tels que Leica THUNDER Imager, utilisent la technologie innovante Clearing de Leica pour éliminer efficacement les signaux d'interférence du plan non focal pendant l'imagerie, présentant des images claires et les avantages de l'imagerie à grande vitesse ;
Le microscope confocal à balayage laser utilise des trous d'épingle pour éliminer les interférences de plan non focal, réalise une coupe optique et obtient des images haute définition et des images tridimensionnelles ;
Les microscopes et nano-microscopes à ultra-haute résolution qui franchissent la limite de diffraction peuvent observer des structures fines inférieures à 200 nm ;
L'invention concerne un système d'imagerie multiphotonique utilisant le principe de l'excitation multiphotonique pour l'imagerie de tissus épais et profonds in vivo ;
Technologie d'imagerie par feuille de lumière à haute résolution temporelle et spatiale, vitesse d'imagerie rapide, haute résolution, faible phototoxicité, particulièrement adaptée à la recherche sur le développement et l'observation dynamique in vivo ;
L'imagerie de durée de vie de fluorescence (FLIM), qui n'est pas affectée par des facteurs tels que la concentration de substance fluorescente, le photoblanchiment, l'intensité de la lumière d'excitation, etc., peut effectuer des mesures fonctionnelles et précises plus approfondies ;
La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et la spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence (FCCS) mesurent le nombre moléculaire et le coefficient de diffusion des molécules fluorescentes, analysant ainsi la concentration moléculaire, la taille moléculaire, la viscosité, le mouvement moléculaire, la liaison/dissociation moléculaire et les propriétés optiques moléculaires ;
La microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF), avec une résolution extrêmement élevée sur l'axe z, est idéale pour étudier la structure moléculaire et la dynamique des surfaces des membranes cellulaires.
