La différence entre le contraste de phase positif et négatif dans un microscope
Selon la configuration et la nature de l'anneau de phase positionné au niveau du plan focal arrière de l'objectif, les échantillons peuvent être observés en contraste de phase positif ou négatif. Ce didacticiel interactif étudie la relation entre le surround (S), la diffraction (D) et les particules lumineuses résultantes (ondes P), ainsi que la microscopie à contraste de phase positive et négative. En outre, la géométrie de la plaque de phase et des images d'échantillons représentatifs sont également présentées.
Lorsque les gens l'utilisent dans leur travail maintenant, la plupart des chercheurs sont dans la différence négative, et maintenant la différence positive ne joue pas beaucoup de rôle dans les travaux de recherche scientifique actuels.
Le didacticiel initialise l'image de phase avec un échantillon sélectionné au hasard qui apparaît dans la fenêtre Image de contraste de phase, et la relation d'onde correspondante est affichée dans le voisin gauche de la fenêtre d'image. Afin de faire fonctionner le didacticiel, utilisez le curseur de la souris pour déplacer la traduction entre le contraste de phase positif et négatif ou le curseur de mode de contraste de phase d'éclairage lumineux. Lorsque le curseur est déplacé, les images qui apparaissent dans la fenêtre d'image à contraste de phase modifient l'apparence de l'échantillon dans le mode d'imagerie actuel défini par le curseur. En outre, sous le graphique de forme d'onde se trouve une plaque de phase qui change de forme pour correspondre au mode d'imagerie sélectionné par le curseur. Pour afficher un nouvel échantillon, utilisez le menu déroulant Échantillon sélectionné pour sélectionner un autre échantillon.
Un tracé de la configuration de la plaque de phase, des relations d'onde et des vecteurs associés à la génération d'images à contraste de phase positif et négatif est présenté à la figure 1. Des exemples d'échantillons imagés par ces techniques sont également présentés. Dans une configuration optique à contraste de phase positif (rangée supérieure de l'image de la figure 1), le front d'onde surround (S) passe à travers la plaque de phase, ce qui entraîne un déphasage net de 180 degrés d'avance de phase, de 1/4 de longueur d'onde ( 1 demi-longueur d'onde). Les fronts d'onde surround avancés sont désormais capables de participer à des interférences destructives avec des ondes diffractées (D) au niveau du plan image intermédiaire. Dans la plupart des cas, le simple fait d'avancer la phase relative du front d'onde environnant seul n'est pas suffisant pour entraîner la génération d'images à contraste élevé dans les microscopes Nikon. En effet, l'amplitude des ondes surround est nettement supérieure à celle des ondes diffractées et supprime l'image résultante produite par interférence d'une fraction du nombre total d'ondes. Afin de réduire le front d'onde environnant à une valeur plus proche de l'amplitude des ondes diffractées (et d'interférer dans le plan image), l'opacité dans l'anneau de phase de l'objectif est obtenue en appliquant un métal semi-transparent (neutre à densité croissante ) revêtement de sol. Les ondes lumineuses environnantes, qui traversent presque complètement l'anneau de phase par conception, sous microscopie à contraste de phase, sont considérablement réduites en amplitude par l'opacité de la plaque de phase à une valeur comprise entre 10 et 30% de l'intensité d'origine.
Parce que l'onde de particules résultante est produite par l'interférence* des fronts d'onde environnants et diffractés, l'amplitude de l'onde de particules (P) produite par l'interférence entre les fronts d'onde arrivant au plan image est maintenant beaucoup plus petite que celle qui l'entoure lorsqu'elle est en sexualité. revêtement de densité appliqué. L'effet net est de convertir la différence de phase relative introduite par le passage de la lumière sortant du plan image à travers l'échantillon en une différence d'amplitude (intensité). Parce que l'œil humain interprétera la différence d'intensité comme un contraste, l'échantillon est maintenant visible dans l'oculaire du microscope et peut également être capturé sur la membrane avec des systèmes de caméra conventionnels, ou numériquement, à l'aide de dispositifs CCD ou CMOS. Tous les systèmes à contraste de phase positif font avancer sélectivement la phase du front d'onde surround linéaire (S) par rapport au front d'onde diffracté sphérique (D). Les spécimens avec un indice de réfraction plus élevé que le milieu environnant apparaissent plus sombres sur un fond gris neutre, tandis que ceux avec un indice de réfraction inférieur à celui du milieu de nage apparaissent plus brillants que le fond gris.
Afin de modifier la séparation spatiale des fronts d'onde diffractés entourant la phase et l'amplitude dans un système optique à contraste de phase, un certain nombre de configurations de plaques de phase ont été introduites. Étant donné que la plaque de phase est située au niveau ou très près du plan focal arrière de l'objectif (plan de diffraction), toute la lumière qui traverse le microscope doit traverser ce composant. La partie de la lame de phase dans son foyer annulaire de condenseur est appelée la région conjuguée, tandis que la région restante est appelée la région complémentaire. La région conjuguée contient le matériau responsable du changement de phase de la lumière environnante (non diffractée) de plus ou moins 90 degrés par rapport au front d'onde diffracté. En général, la zone de l'anneau de phase conjuguée est plus large (environ 25 %) que la zone définie par l'image de l'anneau de condensation afin de réduire la quantité de lumière environnante qui se propage vers la zone complémentaire.
La plupart des plaques de phase disponibles auprès des fabricants de microscopes modernes sont l'une de celles préparées par dépôt sous vide de films minces diélectriques et métalliques sur une plaque de verre ou montées directement sur la surface de la lentille de l'objectif du microscope. Le rôle du film diélectrique est de déphaser la lumière, tandis que le film métallique atténue l'intensité de la lumière non diffractée. Certains fabricants utilisent plusieurs revêtements antireflets combinés avec le film pour réduire la quantité d'éblouissement et de réflexion de la lumière parasite dans le système optique. Si la plaque de phase n'est pas formée sur la surface d'une lentille, elle est généralement cimentée entre des lentilles successives qui résident sur le plan focal près de l'arrière de l'objectif. L'épaisseur et l'indice de réfraction des revêtements diélectrique, métallique et antireflet, ainsi que ceux du ciment optique, sont soigneusement choisis pour produire le déphasage souhaité entre les régions complémentaires et conjuguées de la plaque de phase. En termes optiques, une plaque de phase qui modifie la phase par rapport à la lumière environnante pour diffracter la lumière de 90 degrés (positif ou négatif) est appelée plaque quart d'onde en raison de l'effet de différence de chemin optique sur elle.
Un aperçu de l'inverse de phase positive est illustré à la figure 1. La plaque de contraste de phase positive (côté gauche de la figure 1) propulse l'onde surround, par 1/4 de longueur d'onde, en raison de l'anneau d'érosion dans la plaque de verre, qui peut être réduit par le passage supérieur dans la plaque à haut indice Le chemin physique de l'onde emprunté. En raison de l'interaction avec l'échantillon, lorsque les rayons d'échantillon diffractés (D) sont retardés, la différence de chemin optique entre les ondes encerclantes et diffractées qui émergent de la lame de phase est d'une demi-longueur d'onde par 1/4 de longueur d'onde. Le résultat net est une différence de chemin optique de 180- degrés entre les ondes environnantes et diffractées, ce qui entraîne une interférence destructive pour les échantillons à indice de réfraction élevé entre les plans d'image. La courbe d'amplitude de l'onde d'interférence destructrice opposée à la phase positive est illustrée dans le graphique supérieur de la figure 1. L'onde de particules (P) résultante a une amplitude inférieure à l'onde d'ambiance (S), faisant ainsi apparaître l'objet par rapport à une onde relativement fond plus sombre. En bas, image de l'algue verte Zygnema illustrée à droite (étiquetée DL). Le vecteur représenté par la progression de la longueur d'onde 1/4, qui est représenté par une onde surround tournant dans le sens inverse des aiguilles d'une montre de 90- degrés en contraste de phase positif, apparaît entre la figure et l'image de la figure 1.
Alternativement, l'optique du microscope peut également être fabriquée pour produire une phase négative opposée, comme illustré dans la partie inférieure de la figure 1, auquel cas les ondes surround (S) sont retardées (plutôt qu'avancées) d'un quart de longueur d'onde par rapport à la seule onde diffractée (D). En conséquence, les spécimens avec des indices de réfraction élevés apparaissent plus brillants sur un fond gris plus foncé (voir l'image inférieure étiquetée BM sur la figure 1). En phase négative opposée, la plaque de phase objective contient un anneau surélevé qui retarde la phase (plutôt que d'avancer la phase comme la phase positive opposée), passant un quart de longueur d'onde par rapport à la phase de l'onde diffractée comme onde surround d'ordre zéro. Étant donné que les ondes diffractées ont été retardées d'un quart de longueur d'onde lorsqu'elles traversent l'échantillon, la différence de chemin optique entre les ondes environnantes et diffractées est éliminée et l'échantillon à indice de réfraction élevé interfère de manière constructive au niveau du plan image. Notez que l'onde de particules résultante (P) est plus élevée en amplitude que l'onde surround (S) en contraste de phase négatif. Une inversion de phase négative est également représentée, où le vecteur d'onde de circumnavigation passe par une rotation de 90 degrés dans le sens des aiguilles d'une montre du diagramme vectoriel.
