Application de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale par fluorescence
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), microscope à fluorescence à réflexion interne totale, lorsque la lumière pénètre dans un milieu à indice de réfraction inférieur à partir d'un milieu à indice de réfraction élevé, si l'angle d'incidence est suffisamment grand, toute la lumière est réfléchie sans réfraction, mais dans L'interface des deux milieux produit des ondes évanescentes qui peuvent exciter la fluorescence à moins de 100 nm près de l'interface pour réaliser l'observation de la surface de l'objet. La lumière d'excitation peut être envoyée à travers l'illuminateur d'un microscope à fluorescence conventionnel ou d'un illuminateur spécial, et l'angle d'incidence du laser peut être contrôlé. La méthode d'excitation par champ instantané est utilisée pour empêcher la lumière d'excitation de pénétrer dans le détecteur. La lumière d'excitation à l'interface entre le verre et l'eau produit un plein interne mis en œuvre par réflexion. En raison de l'atténuation exponentielle de la lumière d'excitation, seule la zone d'échantillon très proche de la surface de réflexion totale produira une réflexion de fluorescence, ce qui réduit considérablement l'interférence du bruit de lumière de fond sur la cible d'observation. Cette technologie est donc largement utilisée dans l'observation dynamique. de substances de surface cellulaire.
Schéma de principe de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM)
①Échantillon ②Gamme d'ondes évanescentes ③Verre de protection ④Immersion dans l'huile ⑤Cible ⑥Faisceau d'émission (signal) ⑦Faisceau d'excitation
Afin d'obtenir une réflexion interne totale, un grand angle d'incidence est nécessaire, par exemple, l'angle d'incidence à l'interface verre-eau est supérieur à 61 degrés. Ceci peut être réalisé par un prisme, appelé TIRFM à base de prisme, ou par une lentille d'objectif à grande ouverture numérique, appelée TIRFM de type objectif. Les microscopes à fluorescence à réflexion interne totale actuellement commercialisés sont généralement du type objectif, à haute vitesse et haute précision.
La microscopie à fluorescence à réflexion interne totale est largement utilisée dans certains domaines biologiques car elle permet de réaliser des observations de fluorescence dans une gamme très fine (moins de 100 nm) à la surface des objets. Comme les applications suivantes :
Observation d'images de surface cellulaire : structure de surface de membrane cellulaire, contact de surface cellulaire, dynamique de surface de membrane/localisation de protéines.
Observation et manipulation d'une seule molécule : myosine, actine et ATP marqué au Cy3-.
Mouvement de surface de la membrane cellulaire : tel que l'engloutissement des vésicules, l'exhalation des vésicules et l'exocrine des vésicules. le
Observation du phénomène d'étincelles calciques dans la membrane cellulaire, suivi des canaux ioniques.
Recherche sur la motricité moléculaire : moteurs de rotation, protéines du cytosquelette, polymères, protéines G, protéines en anneau, moteurs nucléotidiques.
Outre le domaine de la biologie, il a également de bonnes applications dans le domaine de la chimie pour l'observation des structures moléculaires chimiques.
