Différences entre les microscopes à fluorescence et les microscopes optiques ordinaires
Les microscopes à fluorescence diffèrent des microscopes optiques conventionnels. Au lieu d'observer les échantillons avec la lumière d'une source de lumière ordinaire, ils utilisent une lumière d'une longueur d'onde spécifique (généralement de la lumière ultraviolette ou bleu-violet) pour exciter les substances fluorescentes présentes dans l'échantillon sur la lame du microscope, provoquant ainsi l'émission de fluorescence par ces substances. Par conséquent, la source lumineuse d’un microscope à fluorescence n’éclaire pas directement l’échantillon ; il agit comme une source d’énergie pour exciter les substances fluorescentes endogènes présentes dans l’échantillon. Nous pouvons voir l’échantillon non pas grâce à l’éclairage de la source lumineuse elle-même, mais parce que les substances fluorescentes à l’intérieur de l’échantillon absorbent l’énergie lumineuse d’excitation et émettent ensuite de la fluorescence.
Il s'ensuit que la caractéristique clé d'un microscope à fluorescence est que sa source de lumière peut fournir une lumière d'excitation d'une bande de longueur d'onde spécifique, permettant aux substances fluorescentes présentes dans l'échantillon inspecté d'émettre une fluorescence d'intensité suffisante. Un microscope à fluorescence doit quant à lui être équipé d'un système de filtre correspondant. C'est un instrument essentiel pour l'histochimie de fluorescence. Un microscope à fluorescence est principalement composé d'une source de lumière ultra haute pression, d'un système de filtres (comprenant des filtres d'excitation et des filtres barrière), d'un système optique et d'un système photographique. Cela fonctionne en utilisant la lumière d’une longueur d’onde spécifique pour exciter les substances fluorescentes.
① Méthodes d'excitation par fluorescenceSelon la plage de longueurs d'onde de la lumière d'excitation, il existe deux types : méthode d'excitation UV (méthode d'éclairage ultraviolet) et méthode d'excitation BV (méthode d'éclairage bleu-violet). La méthode d'excitation UV utilise une lumière ultraviolette inférieure à 400 nm pour l'excitation. Il génère une fluorescence invisible, la fluorescence observée provient donc du spécimen lui-même. Cette méthode distingue facilement la fluorescence spécifique de l’autofluorescence du fond.
② Méthode d'excitation BVLa méthode d'excitation BV utilise une lumière d'excitation allant du violet au bleu centrée à 404 nm et 434 nm. Étant donné que la lumière bleue est utilisée pour irradier l'échantillon, le système de filtre d'excitation pour cette méthode doit bloquer complètement la lumière bleue et laisser passer uniquement la lumière verte et jaune requise. Pour la coloration des anticorps fluorescents, la longueur d'onde d'absorption maximale de la lumière d'excitation est proche de la longueur d'onde d'émission maximale du colorant fluorescent. Pour cette raison, le filtre défini pour l’excitation BV doit utiliser un filtre barrière de coupure. Cette méthode utilise la lumière bleue pour l’excitation, de sorte que l’efficacité de la collecte de fluorescence est relativement élevée et que des images plus lumineuses peuvent être obtenues. Son inconvénient est que la fluorescence au-dessus de 500 nm ne peut pas être détectée et que seules les images jaune-vert peuvent être vues au-dessus de 500 nm. Dans la coloration des anticorps fluorescents, le jugement de la spécificité repose en grande partie sur les informations de couleur, de sorte que l'inconvénient de la méthode d'excitation BV peut constituer une limitation majeure lors de l'examen d'une spécificité subtile.
