Connaissances liées au microscope à fluorescence
Le principe de base de la microscopie confocale à fluorescence : une source lumineuse ponctuelle est utilisée pour irradier l'échantillon et une petite tache lumineuse bien définie se forme sur le plan focal. composé de séparateurs. Le séparateur de faisceau envoie la fluorescence directement au détecteur. Il y a un trou d'épingle devant la source lumineuse et le détecteur, respectivement appelé trou d'épingle d'éclairage et trou d'épingle de détection. La taille géométrique des deux est la même, environ 100-200nm ; par rapport à la tache lumineuse sur le plan focal, les deux sont conjugués, c'est-à-dire que la tache lumineuse traverse une série de lentilles et peut finalement être focalisée sur le sténopé d'éclairage et le sténopé de détection en même temps. De cette manière, la lumière provenant du plan focal peut être convergée dans la portée du trou de détection, tandis que la lumière diffusée provenant du dessus ou du dessous du plan focal est bloquée à l'extérieur du trou de détection et ne peut pas être imagée. Le laser scanne l'échantillon point par point, et le tube photomultiplicateur après avoir détecté le trou d'épingle obtient également l'image confocale de la lumière correspondante point par point, qui est convertie en un signal numérique et transmise à l'ordinateur, et enfin agrégée en un clair image confocale de tout le plan focal sur l'écran.
Chaque image du plan focal est en fait une coupe optique de l'échantillon, et cette coupe optique a toujours une certaine épaisseur, également appelée coupe mince optique. Étant donné que l'intensité lumineuse au point focal est bien supérieure à celle du point non focalisé et que la lumière du plan non focal est filtrée par le trou d'épingle, la profondeur de champ du système confocal est approximativement nulle et le balayage le long du Z -axe peut réaliser une tomographie optique, formant un Observez la section optique bidimensionnelle au point focalisé de l'échantillon. En combinant le balayage du plan XY (plan focal) avec le balayage de l'axe Z (axe optique), l'image tridimensionnelle de l'échantillon peut être obtenue en accumulant des images bidimensionnelles de couches continues et traitées par un logiciel informatique spécial.
C'est-à-dire que le trou d'épingle de détection et le trou d'épingle de source lumineuse sont toujours focalisés sur le même point, de sorte que la fluorescence excitée à l'extérieur du plan focal ne peut pas entrer dans le trou d'épingle de détection.
L'expression simple du principe de fonctionnement du laser confocal est qu'il utilise la lumière laser comme source de lumière. Sur la base de l'imagerie au microscope à fluorescence traditionnelle, il ajoute un dispositif de balayage laser et un dispositif de focalisation conjuguée, et c'est un système d'acquisition et de traitement d'images numériques par contrôle informatique.
