Comment observe-t-on la morphologie des cellules microbiennes au microscope ?
Les microscopes ont été inventés pour voir des objets souriants qui ne peuvent être vus à l'œil nu. Les micro-organismes sont très petits, ils doivent donc être agrandis et observés à l'aide d'un microscope. De plus, il existe de nombreux types de micro-organismes, de sorte que la plupart des microscopes optiques peuvent observer les micro-organismes. La question suivante est de savoir quel type de microscope doit être utilisé pour observer et analyser quels types de micro-organismes. Les microscopes courants pouvant être utilisés pour observer la morphologie microbienne comprennent les microscopes biologiques, les microscopes à contraste de phase, les microscopes inversés, les microscopes à fluorescence, les microscopes confocaux, etc.
Ce qui suit décrit les différents microscopes utilisés pour observer les micro-organismes :
1. Le microscope optique ordinaire utilise la lumière naturelle ou la lumière comme source de lumière, et sa longueur d'onde est d'environ 0,4 μm. La résolution du microscope est la moitié de la longueur d'onde, soit 0,2 μm, et la plus petite image visible à l'œil nu est de 0,2 mm. Par conséquent, l'utilisation d'un miroir à huile (à immersion) pour grossir 1000 fois peut agrandir les particules de 0,2 μm en 0,2 mm visibles à l'œil nu. Les microscopes optiques ordinaires peuvent être utilisés pour l'observation des bactéries, des actinomycètes et des champignons.
2. La microscopie en fond noir est couramment utilisée pour observer la morphologie et le mouvement microbiens non colorés. Une fois le condenseur de champ sombre installé dans le microscope ordinaire, la lumière ne peut pas pénétrer directement depuis le milieu et le champ de vision est sombre. Lorsque l'échantillon reçoit une lumière oblique du bord du condenseur, elle peut être diffusée, de sorte que des micro-organismes brillants tels que des bactéries ou des spirochètes peuvent être observés dans le fond sombre.
3. Microscope à contraste de phase Le microscope à contraste de phase utilise l'effet lumineux de la plaque de différence de phase pour modifier la phase lumineuse et l'amplitude de la lumière directe et convertir la différence de phase lumineuse en différence d'intensité lumineuse. Sous un microscope à contraste de phase, lorsque la lumière traverse un échantillon non coloré, la différence de phase lumineuse est provoquée par l'incohérence de la densité des différentes parties de l'échantillon, et la morphologie, la structure interne et le mode de mouvement des micro-organismes peuvent être observés.
4. Microscope à fluorescence Le microscope à fluorescence est fondamentalement identique au microscope optique ordinaire, la principale différence réside dans la source de lumière, le filtre et le condenseur. À l'heure actuelle, la plupart d'entre eux utilisent des appareils à lumière épi, et des lampes au mercure à haute pression sont couramment utilisées comme sources lumineuses, qui peuvent émettre de la lumière ultraviolette ou bleu-violet. Il existe deux types de filtres : le filtre d'excitation et le filtre d'absorption. En plus des condenseurs à fond clair généraux, les condenseurs à fond sombre peuvent également être utilisés dans les microscopes à fluorescence utilisant la lumière bleue pour améliorer le contraste entre la fluorescence et l'arrière-plan. Cette méthode est applicable à la détection ou à l'identification de bactéries colorées avec des pigments fluorescents ou associées à des anticorps fluorescents.
5. Les microscopes électroniques utilisent le flux d'électrons comme source de lumière et la longueur d'onde est des dizaines de milliers de fois différente de la lumière visible, ce qui améliore considérablement la résolution. Il utilise également une bobine magnétique comme système d'amplification optique, et le grossissement peut atteindre des dizaines de milliers ou des centaines de milliers de fois. Il est souvent utilisé pour l’observation des particules virales et de l’ultrastructure bactérienne.
Observation d'échantillons microbiens non colorés :
Les échantillons non colorés peuvent généralement être utilisés pour observer la morphologie, la puissance et le mouvement des bactéries. Les bactéries sont incolores et transparentes lorsqu'elles ne sont pas colorées et sont observées au microscope principalement par la différence entre l'indice de réfraction des bactéries et celui de l'environnement. Les bactéries avec flagelles se déplacent vigoureusement, tandis que les bactéries sans flagelles présentent un mouvement brownien irrégulier. Les bactéries viables telles que Treponema pallidum, Leptospira et Campylobacter ont des formes et des schémas de mouvement distinctifs, qui revêtent une importance diagnostique. Les méthodes couramment utilisées sont la méthode de chute de pression, la méthode de chute pendante et la méthode capillaire.
1. Appliquez de la vaseline autour du trou concave du verre concave propre en accrochant la méthode des gouttes, utilisez une boucle d'inoculation pour prendre un anneau de suspension bactérienne et placez-le au centre du verre de protection, puis alignez le trou concave du verre concave avec la goutte au centre du lamelle et recouvrez-la, puis retournez-la rapidement, appuyez légèrement sur la lamelle pour la faire adhérer fermement à la vaseline sur le bord du trou concave, et observez sous un microscope à fort grossissement (ou terrain sombre).
2. Prenez un anneau de suspension bactérienne avec une anse d'inoculation et placez-le au centre d'une lame de verre propre par la méthode de chute de pression, et recouvrez délicatement la suspension bactérienne avec un verre de protection, en prenant soin d'éviter les bulles et le débordement de la suspension bactérienne. . Après être resté immobile pendant quelques secondes, observez sous un microscope haute puissance en champ clair (ou en champ sombre).
3. La méthode capillaire est principalement utilisée pour l’examen de la cinétique des bactéries anaérobies. Choisissez généralement 60~70 mm de long. Après avoir siphonné la suspension de bactéries anaérobies à travers un capillaire d'ouverture de 0,5-1,0 mm, sceller les deux extrémités du capillaire avec une flamme. Le capillaire a été fixé sur la lame de verre avec du papier plastique et observé sous une lentille haute puissance en champ sombre.
Observation d'échantillons microbiens colorés au microscope :
Une fois l'échantillon bactérien coloré, en raison du fort contraste de couleur entre les bactéries et l'environnement, les caractéristiques morphologiques des bactéries (telles que la taille, la forme, la disposition, etc.) des bactéries et certaines structures spéciales (telles que (capsules, flagelles, spores, etc.) peuvent être clairement observés au microscope optique ordinaire, et les bactéries peuvent être classées et identifiées en fonction de la réactivité de coloration.
(1) Procédure générale de coloration bactérienne La procédure générale de coloration bactérienne est la suivante : frottis (séchage) – fixation – coloration.
1. Préparation des frottis du sang, des sécrétions, des excrétions, du liquide de ponction et de la culture liquide, et frottis directs en film mince sur des lames de verre ; autopsie ou tissus animaux infectés, enduire la lésion avec un coton-tige pour l'échantillonnage. Pour la préparation de colonies bactériennes ou de pelouses sur milieu solide, utilisez d'abord une anse d'inoculation pour prélever un anneau de solution saline normale et placez-la au centre de la lame de verre, puis utilisez une anse d'inoculation stérile pour prélever une petite quantité de culture et broyer uniformément dans une solution saline normale, étalez-le sur une surface enduite de 1 cm2 et laissez-le sécher naturellement à température ambiante ou sécher lentement à distance.
2. Le but de la fixation est de tuer les bactéries, de coaguler les protéines et la structure bactériennes et de faciliter la coloration ; favoriser l'adhésion des bactéries à la lame pour éviter d'être emportées par l'eau pendant le lavage ; modifier la perméabilité des bactéries aux colorants, ce qui est bénéfique pour la coloration des structures intracellulaires bactériennes. Il est généralement fixé en chauffant avec une flamme et le frottis séché est rapidement passé à travers la flamme 3 fois. Il est préférable de ne pas brûler la peau du dos de la main lorsqu'elle touche la lame.
3. Teinture Selon différents objectifs d'inspection, choisissez différentes méthodes de teinture pour la teinture. Lors de la teinture, ajoutez goutte à goutte la solution colorante pour augmenter la couverture.
4. Mordant Toute substance susceptible d'améliorer l'affinité entre le colorant et l'objet teint, de fixer le colorant sur l'objet teint et de provoquer une modification de la perméabilité de la membrane cellulaire est appelée mordant. L'alun, l'acide tannique, les sels métalliques et l'iode, etc. sont couramment utilisés, et le chauffage est également utilisé pour favoriser la coloration. Les mordants peuvent être utilisés entre la coloration primaire et la contre-coloration, et peuvent également être utilisés après fixation ou contenus dans un fixateur et une coloration.
5. Décoloration Tout agent chimique capable de supprimer la couleur de l'objet teint est appelé décolorant. L'éthanol, l'acétone, etc. sont couramment utilisés comme décolorants. L'agent décolorant peut détecter le degré de stabilité de la combinaison de bactéries et de colorants, qui peut être utilisée pour une coloration différentielle.
6. Contre-coloration Les bactéries ou leurs structures décolorées sont souvent contre-colorées avec une solution de contre-coloration pour faciliter l'observation. La couleur de la solution de contre-coloration est différente de celle de la solution de teinture primaire pour former un contraste net. La contre-coloration ne doit pas être trop forte, afin de ne pas masquer la couleur de la coloration initiale.
