Introduction aux avantages et aux limites de la microscopie à balayage laser multiphotonique
La microscopie laser multiphotonique à balayage est une technique expérimentale développée sur la base de la microscopie laser à balayage. Il offre des performances de coupe optique supérieures pour l’observation tridimensionnelle.
La méthode d’excitation par fluorescence multiphotonique utilise une lumière rouge à grande longueur d’onde ou une lumière proche infrarouge pour acquérir des images de fluorescence haute résolution d’échantillons. Il provoque des dommages minimes aux échantillons vivants et convient donc à l'imagerie de cellules vivantes, en particulier à la recherche par imagerie de tissus vivants épais tels que des tranches de cerveau, des embryons, des organes entiers et même des organismes complets.
Ses principaux avantages se résument comme suit :
L'excitation est réalisée avec de la lumière rouge ou infrarouge, qui présente une faible diffusion de la lumière. (La diffusion par les petites particules est inversement proportionnelle à la puissance quatrième de la longueur d'onde.)
Aucun trou d'épingle n'est requis, ce qui permet une collecte plus efficace des photons dispersés à partir du plan d'imagerie.
Un sténopé ne peut pas distinguer les photons diffusés émis par les zones défocalisées de la zone focale ; la microscopie multiphotonique offre un excellent rapport signal/bruit pour l’imagerie des tissus profonds.
La lumière ultraviolette ou visible utilisée dans l’excitation monophotonique est facilement absorbée et atténuée par les échantillons avant d’atteindre le plan focal, ce qui rend difficile la réalisation d’une excitation profonde.
Dans l'observation microscopique biologique, la préoccupation première est de préserver l'activité physiologique des organismes, en maintenant une teneur en eau, une concentration en ions et une circulation normales de l'oxygène et des nutriments. Lors de l'observation optique, la génération de chaleur et l'énergie photonique doivent être maintenues à des niveaux d'exposition qui ne causent pas de dommages cellulaires.
La microscopie multiphotonique possède de nombreux atouts supplémentaires. Il présente des avantages inégalés par rapport aux microscopes laser conventionnels en termes de résolution tridimensionnelle, de profondeur de pénétration profonde, d'efficacité de diffusion, de suppression du bruit de fond, de rapport signal/bruit et de contrôlabilité de l'imagerie.
La microscopie confocale multiphotonique à balayage laser a été appliquée dans un large éventail de domaines de recherche et pratiques. Il permet une observation tridimensionnelle non invasive d'échantillons dans des conditions naturelles tout en améliorant la résolution et le rapport signal/bruit du système. En utilisant les changements de propriétés des matériaux induits par l’excitation multiphotonique, il permet également le stockage de données tridimensionnelles haute densité et la microfabrication dans des directions tridimensionnelles arbitraires, démontrant ainsi une grande valeur d’application.
Il est prévisible qu'avec les progrès de la mécanique, de la science des matériaux, de la technologie laser et d'autres disciplines connexes, la microscopie confocale multiphotonique à balayage laser réalisera de plus grands progrès et des perspectives d'application plus larges.
