Caractéristiques et applications du microscope confocal laser
Alors que dans un microscope normal, le plan image de l'observation est isolé des plans axiaux voisins en chevauchant le plan focal de l'objectif avec le détecteur, dans un microscope confocal, cette isolation est obtenue en éclairant l'échantillon avec un point de diffraction limité. la lumière et filtrer la lumière parasite en utilisant un sténopé sur le trajet de la lumière collectée au foyer conjugué de ce point de lumière pour obtenir cette isolation et ainsi améliorer la résolution.
Seule la lumière réfléchie par la couche d'échantillon conjuguée peut traverser le trou d'épingle dans le trajet de la lumière de collecte, tandis que le reste des réflexions non pertinentes de la couche d'échantillon sont bloquées par le trou d'épingle. Cela donne une augmentation significative de la résolution. Vous trouverez ci-dessous une comparaison côte à côte de la microscopie à fluorescence multidimensionnelle et de la microscopie confocale du même échantillon épais. Lorsqu'une série d'images est prise à différents plans focaux, une image communément appelée « pile z » est produite, qui montre les gains de résolution et de contraste fournis par la microscopie confocale et les raisons sous-jacentes de ces gains. On peut voir que l’examen de l’image au sommet de la pile, là où le plan d’imagerie est au-dessus du tissu, révèle une grande quantité de lumière diffusée dans l’image de fluorescence, alors que l’image du microscope confocal apparaît noire. Cette réduction de PSF dans la direction axiale contribue directement à la différence de résolution observée à l'interface optique au milieu de la pile z.
Imagerie par balayage de coupe optique
Une autre caractéristique de la microscopie confocale à balayage laser est qu'il s'agit d'une technique d'imagerie par balayage. Les techniques traditionnelles d'éclairage à grand champ illuminent l'ensemble de l'échantillon afin que l'image puisse être capturée directement par l'œil nu ou par un détecteur, mais le LSCM utilise un ou plusieurs faisceaux de lumière focalisés pour balayer l'échantillon, de sorte que l'image résultante soit appelée un tranche optique, comme le montre le schéma suivant. La différence entre l’éclairage traditionnel à grand champ et l’éclairage confocal à balayage laser est indiquée ci-dessous.
Par conséquent, une méthode pratique de microscopie confocale moderne est présentée dans la figure ci-dessous. La lumière d'excitation du laser passe à travers un miroir dichroïque et est balayée à travers une paire de miroirs galvanométriques dans les directions x et y de l'échantillon, et l'excitation (ou réflexion) de l'échantillon passe à travers un trou d'épingle dans le PMT. détecteur à enregistrer, et l'image numérisée enregistrée est reconstruite par un ordinateur pour produire une image réelle de l'échantillon.
