Principe et application de la microscopie à fluorescence
(1) Le principe et les caractéristiques structurelles du microscope à fluorescence : le microscope à fluorescence utilise une source lumineuse ponctuelle à haute efficacité lumineuse pour émettre de la lumière d'une certaine longueur d'onde (telle que la lumière ultraviolette 3 650 pouces ou la lumière bleue violette 4 200 pouces) à travers le système de filtre comme lumière d'excitation pour exciter l'échantillon. Une fois que la substance fluorescente à l'intérieur émet une fluorescence de différentes couleurs, elle est observée à travers le grossissement de l'objectif et de l'oculaire. De cette manière, sous un fond à fort contraste, même si la fluorescence est très faible, il est facile à identifier et présente une grande sensibilité. Il est principalement utilisé pour la recherche de la structure et de la fonction cellulaire et de la composition chimique. La structure de base d'un microscope à fluorescence est composée d'un microscope optique ordinaire plus quelques accessoires (tels qu'une source de lumière fluorescente, un filtre d'excitation, un séparateur de faisceau bicolore et un filtre de blocage, etc.). Source de lumière fluorescente - utilise généralement une lampe au mercure à ultra haute pression (50-200W), qui peut émettre de la lumière de différentes longueurs d'onde, mais chaque substance fluorescente a une longueur d'onde d'excitation qui produit la fluorescence la plus forte, il est donc nécessaire d'ajouter un filtre d'excitation (généralement, il existe des filtres d'excitation ultraviolets, violets, bleus et verts), qui ne laissent passer que la lumière d'excitation d'une certaine longueur d'onde et irradient l'échantillon, tout en absorbant une autre lumière. Après que chaque substance a été irradiée par une lumière d'excitation, elle émet une fluorescence visible avec une longueur d'onde plus longue que la longueur d'onde d'irradiation en un temps très court. La fluorescence est spécifique et généralement plus faible que la lumière d'excitation. Afin d'observer une fluorescence spécifique, un filtre de blocage (ou de suppression) est nécessaire derrière la lentille d'objectif. Il a deux fonctions : l'une est d'absorber et d'empêcher la lumière d'excitation de pénétrer dans l'oculaire, afin de ne pas perturber la fluorescence et endommager les yeux ; l'autre est de sélectionner et de laisser passer la fluorescence spécifique, montrant une couleur fluorescente spécifique. Les deux filtres doivent être utilisés ensemble.
Il existe deux types de microscopes à fluorescence en fonction de leurs chemins optiques :
1. Microscope à fluorescence à transmission : La source de lumière d'excitation excite la fluorescence à travers le matériau de l'échantillon à travers la lentille du condenseur. Un collecteur à fond noir est couramment utilisé, et un collecteur ordinaire peut également être utilisé pour ajuster le miroir afin que la lumière d'excitation soit transmise et contournée vers l'échantillon. Il s'agit d'un microscope à fluorescence à l'ancienne. L'avantage est que la fluorescence est forte à faible grossissement, et l'inconvénient est que la fluorescence diminue avec l'augmentation du grossissement. Par conséquent, il est préférable d'observer des matériaux d'échantillons plus grands.
2. Microscope à épi-fluorescence Il s'agit d'un nouveau type de microscope à fluorescence développé à l'époque moderne. La différence est que la lumière d'excitation tombe de la lentille d'objectif à la surface de l'échantillon, c'est-à-dire que la même lentille d'objectif est utilisée comme condenseur d'éclairage et comme lentille d'objectif pour collecter la fluorescence. Un séparateur de faisceau dichroïque doit être ajouté dans le trajet de la lumière, qui est à 45 degrés de l'uranium léger. La lumière d'excitation est réfléchie dans la lentille d'objectif et collectée sur l'échantillon. La fluorescence générée par l'échantillon et la lumière d'excitation réfléchie par la surface de la lentille de l'objectif et la surface du verre de protection pénètrent dans l'objectif en même temps et reviennent au séparateur de faisceau bicolore pour rendre la lumière d'excitation séparée de la fluorescence. , la lumière d'excitation résiduelle est absorbée par des filtres de blocage. Si vous passez à une combinaison de différents filtres d'excitation/séparateurs de faisceau bicolores/filtres de blocage, les besoins de différents produits de réaction fluorescents peuvent être satisfaits. L'avantage de ce type de microscope à fluorescence est que l'éclairage du champ de vision est uniforme, l'imagerie est claire et plus le grossissement est important, plus la fluorescence est forte.
(2) Comment utiliser le microscope à fluorescence.
1. Allumez la source de lumière, la lampe au mercure à ultra haute pression doit se réchauffer pendant quelques minutes pour atteindre le point le plus lumineux.
2. Pour le microscope à fluorescence à transmission, le filtre d'excitation requis doit être installé entre la source lumineuse et le condenseur, et le filtre de blocage correspondant doit être installé derrière l'objectif. Les microscopes à épi-fluorescence doivent insérer le filtre d'excitation/séparateur de faisceau bicolore/filtre de blocage requis dans les fentes du trajet lumineux.
3. Observez avec une lentille à faible grossissement et ajustez le centre de la source lumineuse en fonction du dispositif de réglage de différents types de microscopes à fluorescence afin qu'il soit situé au centre de l'ensemble du point d'éclairage.
4. Placez la feuille de spécimen et observez après la mise au point. Une attention particulière doit être portée lors de l'utilisation : ne pas observer directement avec le filtre final, afin de ne pas endommager les yeux ; lors de l'observation de l'échantillon avec une lentille à huile, une lentille à huile spéciale sans fluorescence doit être utilisée ; une fois la lampe au mercure à haute pression éteinte, elle ne peut pas être rallumée immédiatement et doit être testée. Il peut être redémarré après 5 minutes, sinon il sera instable et affectera la durée de vie de la lampe au mercure.
(3) Observation À l'aide d'un filtre de lumière bleu-violet sous un microscope à fluorescence sur la plate-forme d'enseignement, on peut voir que les cellules colorées avec 0,01 % de colorant fluorescent orange acridine, le noyau et le cytoplasme sont excités pour produire deux couleurs différentes de fluorescence (vert foncé) et rouge orangé).
