Principe et caractéristiques structurelles des microscopes à fluorescence
La source de lumière fluorescente utilise généralement une lampe au mercure à ultra haute pression (50 à 200 W), qui émet de la lumière de différentes longueurs d'onde. Cependant, chaque substance fluorescente possède une longueur d’onde d’excitation spécifique qui génère une fluorescence intense. Pour cette raison, un filtre d'excitation (généralement disponible en types ultraviolet, violet, bleu et vert) est nécessaire pour permettre uniquement à la lumière d'excitation d'une longueur d'onde spécifique de traverser et d'irradier l'échantillon, tout en absorbant toutes les autres longueurs d'onde.
Lorsqu'elle est irradiée par une lumière d'excitation, chaque substance émet une fluorescence visible avec une longueur d'onde plus longue que la lumière d'excitation dans un laps de temps extrêmement court. La fluorescence est très spécifique et généralement plus faible que la lumière d'excitation. Pour observer cette fluorescence spécifique, un filtre barrière (ou suppression) doit être installé derrière l'objectif. Il remplit deux fonctions : premièrement, il absorbe et bloque la lumière d'excitation de pénétrer dans l'oculaire pour éviter d'interférer avec l'observation de la fluorescence et d'endommager les yeux ; Deuxièmement, il transmet sélectivement une fluorescence spécifique pour produire une couleur fluorescente distincte. Les deux types de filtres doivent être sélectionnés et utilisés par paires.
Les microscopes à fluorescence sont divisés en deux types en fonction de leur chemin optique :
1. Microscope à fluorescence à lumière transmise
Dans cette conception, la source de lumière d’excitation traverse le condenseur et le matériau de l’échantillon pour exciter la fluorescence. Un condenseur à fond noir est couramment utilisé, bien qu'un condenseur standard puisse également être appliqué ; le miroir réfléchissant est ajusté pour rediriger et irradier latéralement la lumière d'excitation sur l'échantillon. Il s’agit d’un type de microscope à fluorescence relativement ancien. Son avantage est une forte fluorescence à faible grossissement, tandis que son inconvénient est que l'intensité de la fluorescence diminue à mesure que le grossissement augmente. Il est donc mieux adapté à l’observation de spécimens de plus grande taille.
2. Microscope à épifluorescence
Il s'agit d'un type de microscope à fluorescence moderne et nouvellement développé. Contrairement à la conception à lumière transmise, la lumière d'excitation est projetée vers le bas à travers la lentille d'objectif sur la surface de l'échantillon - la même lentille d'objectif sert à la fois de condenseur d'éclairage et d'objectif collecteur de fluorescence. Un séparateur de faisceau dichroïque est installé dans le chemin optique à un angle de 45 degrés par rapport à l'axe optique. La lumière d'excitation est réfléchie dans la lentille de l'objectif et focalisée sur l'échantillon. La fluorescence générée par l'échantillon, ainsi que la lumière d'excitation réfléchie par les surfaces de la lentille d'objectif et de la lamelle, pénètre simultanément dans la lentille d'objectif et retourne au séparateur de faisceau dichroïque, qui sépare la lumière d'excitation de la fluorescence. La lumière d’excitation restante est ensuite absorbée par le filtre barrière.
En échangeant les blocs filtrants avec différentes combinaisons de filtre d'excitation, de séparateur de faisceau dichroïque et de filtre barrière, les exigences relatives aux différents produits de réaction fluorescents peuvent être satisfaites. Les avantages de ce type de microscope à fluorescence comprennent un éclairage de champ uniforme, une imagerie nette et une intensité de fluorescence croissante à des grossissements plus élevés.
