Principes de la microscopie confocale
Le microscope confocal est un instrument d'imagerie de haute précision qui a émergé et s'est développé dans les années 1980, et est un instrument de recherche scientifique essentiel pour l'étude des structures submicroniques. Avec le développement des ordinateurs, des logiciels de traitement d'images et des lasers, les microscopes confocaux ont également connu un grand développement, et sont désormais largement utilisés dans les domaines de la biologie, des microsystèmes et de la mesure des matériaux. Le microscope confocal est un nouveau type de microscope intégrant le principe confocal, la technologie de balayage et la technologie de traitement d'infographie. Ses principaux avantages sont : haute résolution latérale et haute résolution axiale, et suppression efficace de la lumière parasite, avec un contraste élevé.
Une configuration de microscope confocal typique consiste à placer deux petits trous sur le plan conjugué du plan focal de l'objet mesuré, dont l'un est placé devant la source lumineuse et l'autre est placé devant le détecteur, comme illustré à la figure 1. On peut voir sur la figure que lorsque l'échantillon mesuré est dans le plan de quasi-focalisation, l'intensité lumineuse collectée par l'extrémité de détection est la plus grande ; lorsque l'échantillon mesuré est en position hors foyer, la tache lumineuse côté détection se diffuse et l'intensité lumineuse décroît rapidement. Par conséquent, seule la lumière émise par des points sur le plan focal peut passer à travers le sténopé de sortie, tandis que la lumière émise par des points en dehors du plan focal est défocalisée sur le plan du sténopé de sortie, et la plupart d'entre eux ne peuvent pas passer à travers le sténopé central. Par conséquent, le point cible d'observation sur le plan focal apparaît lumineux et le point de non-observation apparaît noir comme arrière-plan, augmentant le contraste et clarifiant l'image. Pendant le processus d'imagerie, les deux trous d'épingle sont confocaux, le point confocal est le point détecté et le plan où se trouve le point détecté est le plan confocal.
La taille du trou d'épingle au niveau du détecteur en microscopie confocale joue un rôle critique. Il affecte directement la résolution et le rapport signal/bruit du système. Si le trou d'épingle est trop grand, l'effet de détection confocale ne sera pas atteint, ce qui non seulement réduit la résolution du système, mais introduit également plus de lumière parasite ; si le trou d'épingle est trop petit, cela réduira l'efficacité de la détection et réduira l'image microscopique. luminosité. Des études ont montré que lorsque le diamètre du trou d'épingle est égal au diamètre du disque d'Airy, les exigences confocales sont satisfaites et l'efficacité de détection n'est pas significativement réduite. Étant donné que le diamètre du trou d'épingle est généralement de l'ordre du micron, s'il y a un écart entre le point focal du faisceau laser et la position du trou d'épingle, une distorsion du signal se produira. Par conséquent, les microscopes confocaux utilisent généralement un système d'autofocus, ce qui augmente pratiquement le temps de mesure.
Le microscope confocal laser à balayage étant une imagerie ponctuelle, pour obtenir une image bidimensionnelle de l'objet, il est nécessaire d'utiliser un balayage bidimensionnel dans les directions x et y. Différents microscopes utilisent différentes méthodes de balayage :
(1) Numérisation d'objets. C'est-à-dire que l'objet lui-même se déplace selon une certaine loi, tandis que le faisceau lumineux reste inchangé. Avantages : chemin optique stable ; Inconvénients : une grande table de numérisation est nécessaire, la vitesse de numérisation est donc fortement limitée.
(2) Un système de balayage de faisceau est formé en utilisant un galvanomètre réfléchissant. C'est-à-dire qu'en contrôlant le galvanomètre à balayage, la tache lumineuse focalisée est régulièrement réfléchie vers une certaine couche de l'objet pour compléter le balayage bidimensionnel. Son avantage est qu'il a une grande précision et est souvent utilisé pour des mesures de haute précision. La vitesse de numérisation s'est améliorée par rapport à la numérisation d'objets, mais elle n'est toujours pas rapide.
(3) Utilisez l'élément de déviation acousto-optique pour le balayage, et le balayage est réalisé en changeant la fréquence de sortie de l'onde sonore, puis en changeant la direction de transmission de l'onde lumineuse. Son avantage exceptionnel est que la vitesse de numérisation est très rapide. Le système de balayage développé par les États-Unis utilise un déflecteur acousto-optique pour générer des images vidéo en temps réel. Il ne faut que 1/30 s pour numériser une image bidimensionnelle et il atteint presque une sortie en temps réel.
(4) Analyse de disque Nipkow. Le processus de numérisation est terminé en faisant tourner le disque Nipkow tout en gardant les autres composants immobiles. Il peut être imagé en une seule fois et la vitesse est très rapide. Cependant, étant donné que le faisceau d'imagerie est une lumière hors axe, l'aberration hors axe de la lentille doit être corrigée, et le taux d'utilisation de l'énergie lumineuse est très faible.
