Techniques de coloration et observation microscopique des micro-organismes
1. Objectif
1.1 Apprendre les techniques de base des frottis microbiens et de la coloration.
1.2 Maîtriser la méthode simple de coloration des bactéries.
1.3 Comprendre au préalable les caractéristiques morphologiques des bactéries et consolider les connaissances sur l'utilisation des lentilles à huile et les techniques d'opération aseptique.
2 principes
L'étalement et la coloration des bactéries sont une technique de base dans les expériences de microbiologie. Les cellules bactériennes sont petites et transparentes, ce qui les rend difficiles à identifier au microscope optique ordinaire ; ils doivent être tachés. Un seul colorant est utilisé pour teindre les bactéries, de sorte que les bactéries colorées forment une nette différence de couleur par rapport à l'arrière-plan, afin que leur morphologie et leur structure puissent être observées plus clairement. Cette méthode est facile à mettre en œuvre et adaptée à l’observation de la forme générale des cellules bactériennes et de la disposition des bactéries. Les colorants basiques sont couramment utilisés pour une coloration simple. En effet, dans les solutions neutres, alcalines ou faiblement acides, les cellules bactériennes sont généralement chargées négativement, et lorsque les colorants basiques sont ionisés, la partie colorante de leurs molécules est chargée positivement, elles sont donc alcalines. La partie colorante du colorant se combine facilement avec les bactéries pour les colorer. Les cellules bactériennes colorées contrastent fortement avec l’arrière-plan, ce qui les rend plus faciles à identifier au microscope. Les colorants couramment utilisés pour la teinture simple comprennent le bleu de méthylène, le violet cristallin, la fuchsine basique, etc. Lorsque les bactéries décomposent les sucres et produisent de l'acide, provoquant une baisse du pH du milieu de culture, la charge positive des bactéries augmente. À l’heure actuelle, des colorants acides tels que l’éosine, la fuchsine acide ou le rouge Congo peuvent être utilisés pour la coloration. Les bactéries doivent être fixées avant la coloration. Il a deux objectifs : l’un est de tuer les bactéries et de les faire adhérer à la lame de verre ; l'autre est d'augmenter leur affinité pour les colorants. Deux méthodes couramment utilisées sont le chauffage et la fixation chimique. Lors de la fixation, essayez de conserver la forme originale des cellules.
3 matériaux
3.1 Bactéries : culture inclinée sur gélose nutritive de Bacillus subtilis 12-18 h, culture inclinée sur gélose nutritive de 24 h de Staphylococcus aureus, culture inclinée sur gélose nutritive de 24 h d'Escherichia coli, culture inclinée sur gélose de levure de boulanger.
3.2 Agent colorant : colorant alcalin bleu de méthylène de Lu (ou colorant violet cristallin d'oxalate d'ammonium), colorant fuchsine d'acide carbolique.
3.3 Instruments ou autres ustensiles : microscope, lampe à alcool, lame, anse d'inoculation, porte-lames, flacon double couche (contenant de l'huile de cèdre et du xylène), papier cristallin, sérum physiologique ou eau distillée, etc.
4. Processus : frottis → séchage → fixation → coloration → lavage → séchage → examen microscopique.
5 étapes
5.1 Frottis : Prendre deux lames de verre propres et sans huile. Dans des conditions stériles, mettez une petite goutte de solution saline normale (ou d’eau distillée) sur chaque centre de la lame de verre. Utilisez une anse d'inoculation pour stériliser les bactéries de Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus et Escherichia coli, prélever un peu de pelouse bactérienne dans les gouttelettes d'eau en biais, bien mélanger et appliquer en une fine pellicule. Si vous utilisez un frottis en suspension bactérienne (ou culture liquide), vous pouvez utiliser une anse d'inoculation pour prélever 2 à 3 anses et les appliquer directement sur la lame. Attention à ne pas laisser tomber trop de sérum physiologique (eau distillée) et à éliminer les bactéries et à l'appliquer uniformément et pas trop épaisse.
5.2 Séchage Sécher naturellement à température ambiante. Vous pouvez également le chauffer légèrement sur une lampe à alcool avec la face enduite vers le haut pour le sécher. Mais veillez à ne pas trop vous approcher de la flamme, car une température trop élevée détruirait la morphologie des bactéries.
5.3 Fixation Si un séchage chauffé est utilisé, la fixation et le séchage sont combinés en une seule étape et la méthode est la même que celle du séchage. Enduire, sécher et thermofixer.
5.4 Coloration : Placez la lame à plat sur le support pour lames et ajoutez 1 à 2 gouttes de solution colorante sur le frottis (il convient que la solution colorante recouvre simplement le film du frottis). Colorer avec le bleu de méthylène basique de Lu pendant 1 à 2 minutes et colorer avec de la fuchsine d'acide carbolique (ou du violet cristallin d'oxalate d'ammonium) pendant environ 1 minute.
5.5 Lavage à l'eau : Videz la solution colorante et rincez délicatement à l'eau du robinet à partir d'une extrémité de la lame jusqu'à ce que l'eau qui s'écoule du frottis soit incolore. Lors du lavage à l'eau, ne lavez pas la surface enduite directement avec de l'eau. Le débit d'eau ne doit pas être trop rapide ni trop important pour éviter que le film de frottis ne tombe.
5.6 Séchage : Secouez les gouttelettes d'eau sur la lame et séchez naturellement, séchez-les avec un sèche-cheveux ou absorbez-les avec du papier absorbant (veillez à ne pas essuyer les bactéries). 5.7 Examen microscopique Une fois le frottis sec, procéder à un examen microscopique. Le frottis doit être complètement sec avant d’être visualisé avec une lentille à huile.
6 Résultats Dessiner la morphologie d'E. coli et de Micrococcus luteus observée après coloration unique.
