La différence entre le microscope à fluorescence (deux photons, confocale) et le microscope ordinaire
Le principe de base de l'excitation à deux photons est qu'à une densité de photons élevée, les molécules fluorescentes peuvent absorber simultanément deux photons à longue longueur d'onde et émettre un photon de longueur d'onde plus courte après une courte période de vie de l'état soi-disant excité; L'effet est le même que l'utilisation d'un photon avec la moitié de la longueur d'onde de la longue longueur d'onde pour exciter les molécules fluorescentes. L'excitation de deux photons nécessite une densité de photons élevée et afin d'éviter les cellules endommagées, la microscopie à deux photons utilise des lasers à impulsions à modélisation à haute énergie. Le laser émis par ce laser a une énergie maximale élevée et une faible énergie moyenne, avec une largeur d'impulsion de seulement 100 fémtosecondes et une fréquence allant jusqu'à 80 à 100 mégahertz. Lorsque vous utilisez une lentille objective d'ouverture numérique élevée pour concentrer les photons d'un laser pulsé, la densité de photons au point focal de l'objectif est la plus élevée et l'excitation à deux photons ne se produit qu'au point focal de l'objectif. Par conséquent, le microscope à deux photons ne nécessite pas de stérophile confocal, ce qui améliore l'efficacité de la détection de fluorescence.
Dans les phénomènes de fluorescence généraux, en raison de la faible densité de photons de la lumière d'excitation, une molécule fluorescente ne peut absorber qu'un seul photon à la fois, puis émettre un autre photon fluorescent par la transition radiative, qui est connue sous le nom de fluorescence de photons unique. Pour les processus d'excitation de fluorescence utilisant des lasers comme sources lumineuses, des phénomènes de fluorescence à deux photons ou même multiphotoniques peuvent se produire. Dans ce cas, la source de lumière d'excitation utilisée a une forte intensité et une densité de photons qui répond à l'exigence de molécules fluorescentes pour absorber deux photons simultanément. Dans le processus d'utilisation d'un laser général comme source de lumière d'excitation, la densité des photons est encore insuffisante pour produire un phénomène d'absorption à deux photons. En règle générale, des lasers à impulsions Femtoseconde sont utilisés, avec une puissance instantanée atteignant le niveau de mégawatt. Par conséquent, la longueur d'onde de la fluorescence à deux photons est plus courte que celle de la lumière d'excitation, équivalente à l'effet produit par l'excitation de la moitié d'excitation de la longueur d'onde.
Connaissances liées à la microscopie à fluorescence confocale
Le principe de base de la microscopie à fluorescence confocale est d'utiliser une source de lumière ponctuelle pour irradier l'échantillon, formant une petite tache lumineuse bien définie sur le plan focal. La fluorescence émise par cet endroit après l'irradiation est collectée par la lentille objective et renvoyée le long du chemin d'irradiation d'origine vers le séparateur de faisceau composé d'un miroir dichroïque. Le spectromètre envoie une fluorescence directement au détecteur. Il y a un trou d'épingle devant à la fois la source lumineuse et le détecteur, appelé stérophile d'éclairage et sténopé de détection, respectivement. Les dimensions géométriques des deux sont cohérentes, approximativement 100-200 nm; Par rapport à la tache lumineuse du plan focal, les deux sont conjugués, ce qui signifie que le point lumineux passe à travers une série de lentilles et peut finalement se concentrer à la fois sur le trou d'éclôme d'éclairage et le trou d'épingle de détection simultanément. De cette façon, la lumière du plan focal peut converger dans la plage du trou de détection, tandis que la lumière diffusée par-dessus ou en dessous du plan focal est bloquée à l'extérieur du trou de détection et ne peut pas être imagée. En balayant l'échantillon point à point avec un laser, le tube photomultiplier après avoir détecté le trou de la forme sombre obtient également l'image confocale correspondante du point de vue de lumière, la convertit en un signal numérique et la transmet à l'ordinateur, et l'agrégate enfin en une image confocale claire de l'ensemble du plan focal à l'écran.
