Le volume des blocs d’échantillons de tissus
Sur les microscopes équipés d'une lentille condensatrice, vous pouvez déplacer le condenseur de haut en bas pour régler la luminosité à un niveau approprié. De plus, vous pouvez modifier l'ouverture du diaphragme à iris pour obtenir une luminosité appropriée. Si la lumière est trop faible, soulevez le condenseur de manière appropriée et ouvrez plus largement l'ouverture du diaphragme à iris. Si la lumière est trop forte, abaissez le condenseur de manière appropriée et réduisez l'ouverture du diaphragme à iris. Si la lumière reste éblouissante après ces réglages, placez un filtre approprié sur le support sous le condenseur pour obtenir un éclairage satisfaisant. Naturellement, la maîtrise du réglage de la position verticale du condenseur, de la régulation de l'ouverture du diaphragme à iris et de la sélection des filtres appropriés nécessite une expérience pratique accumulée au fil du temps.
Un autre aspect critique de la microscopie biologique réside dans les procédures d’échantillonnage des matériaux et d’isolement cellulaire. Après lyophilisation (FD), inclusion de résine et coupe ultrafine congelée, un soin extrême doit être pris pour préserver la composition élémentaire de tous les composants cellulaires sans endommager les cellules destinées à l’observation et à l’analyse. La microanalyse aux rayons X implique des procédures complexes et des coûts élevés. Il serait regrettable de tirer des conclusions erronées si les cellules examinées après une préparation longue et en plusieurs étapes sont endommagées ou non viables. Par exemple, les cardiomyocytes isolés par digestion par la collagénase présentent deux formes morphologiques : des cellules allongées en forme de bâtonnet et des cellules rondes. Les cellules rondes sont des cellules mourantes endommagées, blessées lors de l'isolement cellulaire.
Le contenu et la répartition des électrolytes diffèrent considérablement entre ces deux types de cellules. Les cardiomyocytes ronds contiennent des niveaux de sodium extrêmement élevés et des niveaux de potassium très faibles, ainsi qu'une concentration de calcium nettement élevée dans les mitochondries. Une vérification croisée avec d'autres méthodes analytiques confirme que la teneur élevée en sodium, la faible teneur en potassium et la teneur élevée en calcium mitochondrial des cellules rondes résultent de dommages causés à la membrane cellulaire lors de l'isolement.
La cryofixation des cellules et des tissus commence généralement par une congélation en plongée, suivie d'un stockage dans l'azote liquide. La surgélation en plongée est cruciale pour la qualité de la conservation. Les cellules vivantes et les tissus frais contiennent de l’eau en abondance. Lors de la congélation en plongée, les parties de cellules ou de tissus qui entrent en contact direct avec le cryogène (en particulier l'azote liquide) gèlent et se fixent en premier, formant une coque gelée qui empêche une congélation rapide et une fixation de la région centrale de l'échantillon. Par conséquent, des cristaux de glace sont fréquemment observés dans la zone centrale des cellules plus grandes lors de la microanalyse aux rayons X.
Pour éviter ce problème, des cryogènes ayant un point de fusion supérieur à celui de l'azote liquide mais inférieur à −80 degrés sont adoptés. Parmi les différentes options disponibles, le propane liquide est facile à obtenir, peu coûteux et offre un taux de refroidissement extrêmement rapide (point d'ébullition : -42,12 degrés ; point de fusion : -187,1 degrés ; poids moléculaire : 44,1). Son seul inconvénient est l'inflammabilité.
