Deux méthodes courantes d'observation au microscope
1. Observation en champ sombre
L'observation en fond noir utilise un éclairage en fond noir. Contrairement à l’observation en fond clair, la lumière éclairante n’est pas vue directement ; seule la lumière réfléchie ou diffractée par l'échantillon est détectée. En conséquence, le champ de vision présente un fond sombre tandis que l’échantillon apparaît clair.
L'observation en fond noir est basée sur l'effet Tyndall en optique. Les particules de poussière sont invisibles à l’œil humain sous une lumière directe intense en raison de la diffraction de la lumière. Lorsque la lumière frappe les particules obliquement, la réflexion de la lumière fait apparaître les particules agrandies et visibles.
L'accessoire spécial requis pour l'observation en fond noir est un condenseur de fond noir. Il empêche le faisceau lumineux de passer verticalement vers le haut à travers l’échantillon. Au lieu de cela, il redirige la lumière pour éclairer l’échantillon selon un angle oblique. La lumière éclairante ne pénètre pas directement dans l'objectif et des images lumineuses sont formées par la lumière réfléchie et diffractée par la surface de l'échantillon. La résolution de l’observation en fond noir est bien supérieure à celle de l’observation en fond clair, atteignant 0,02 à 0,004 μm.
2. Microscopie à contraste de phase
Dans le développement des microscopes optiques, l’invention de la microscopie à contraste de phase représente une réalisation majeure de la microscopie moderne. L’œil humain ne peut distinguer que la longueur d’onde (couleur) et l’amplitude (luminosité) des ondes lumineuses. Pour les échantillons biologiques incolores et transparents, la lumière traverse avec peu de changement de longueur d'onde ou d'amplitude, ce qui les rend difficiles à observer dans des conditions de fond clair.
La microscopie à contraste de phase effectue une inspection basée sur la différence de chemin optique de l'échantillon. Il utilise efficacement les interférences de la lumière pour convertir les différences de phase (invisibles à l’œil humain) en différences d’amplitude distinctes. Même les substances transparentes incolores peuvent être clairement visualisées. Cela facilite grandement l’observation des cellules vivantes, c’est pourquoi la microscopie à contraste de phase est largement utilisée avec les microscopes inversés.
Le principe de base du microscope à contraste de phase est de convertir la différence de trajet optique de la lumière visible transmise à travers l'échantillon en une différence d'amplitude, améliorant ainsi le contraste entre les différentes structures et les rendant clairement visibles. Après avoir traversé l'échantillon, la lumière se réfracte, s'écarte de sa trajectoire d'origine et est retardée d'un quart de longueur d'onde. Un retard ou une avance supplémentaire de 1/4 de longueur d'onde entraîne une différence de chemin optique totale de 1/2 longueur d'onde. Les deux faisceaux se superposent et interfèrent, augmentant ou diminuant l'amplitude pour améliorer le contraste. Structurellement, le microscope à contraste de phase présente deux caractéristiques particulières qui le distinguent des microscopes optiques ordinaires.
