Avantages et limites de la microscopie à balayage laser multiphotonique
Avantages
① L'excitation est réalisée avec de la lumière rouge ou infrarouge, conduisant à une faible diffusion de la lumière. La diffusion par les petites particules est inversement proportionnelle à la puissance quatrième de la longueur d'onde.
② Aucun trou d'épingle n'est requis, ce qui permet de collecter davantage de photons dispersés à partir du plan d'imagerie.
③ Un sténopé ne peut pas distinguer les photons diffusés émis depuis des régions floues ou du point focal. La microscopie multiphotonique permet d'obtenir un excellent rapport signal/bruit pour l'imagerie profonde.
④ La lumière ultraviolette ou visible utilisée pour l'excitation d'un photon unique a tendance à être absorbée et atténuée par l'échantillon avant que le faisceau n'atteigne le plan focal, ce qui rend difficile l'excitation des couches profondes.
⑤ Pour l'observation microscopique biologique, la principale considération est de préserver l'activité biologique des spécimens, de maintenir l'humidité, la concentration ionique et la circulation de l'oxygène et des nutriments. Pour l’observation optique, la chaleur et l’énergie photonique doivent être maintenues à des niveaux d’irradiation qui n’endommagent pas les cellules.
⑥ Les microscopes multiphotoniques ont de nombreux autres avantages. En termes de résolution 3D, de pénétration profonde, d'efficacité de diffusion, de lumière de fond, de rapport signal/bruit et de contrôlabilité, ils possèdent des caractéristiques supérieures indisponibles ou incomparables aux microscopes laser conventionnels.
Les microscopes confocaux multiphotoniques à balayage laser ont été étendus à divers domaines de recherche et d'application. Ils permettent une observation tridimensionnelle non invasive d'échantillons dans des conditions naturelles et améliorent la résolution et le rapport signal/bruit du système. En utilisant les changements dans les propriétés des matériaux induits par l'excitation multiphotonique, le stockage de données 3D haute densité et la microfabrication dans des directions tridimensionnelles arbitraires peuvent également être réalisés, présentant une valeur d'application élevée. On s'attend à ce qu'avec de nouveaux progrès dans la mécanique, les matériaux, la technologie laser et d'autres domaines liés à la microscopie confocale multiphotonique, les microscopes confocaux multiphotoniques à balayage laser connaîtront un plus grand développement et une application plus large.
Limites
① Il ne prend en charge que l'imagerie par fluorescence.
② Si l'échantillon contient des chromophores qui absorbent la lumière d'excitation (tels que des pigments), des dommages thermiques à l'échantillon peuvent survenir.
③ La résolution est légèrement réduite. Bien que cela puisse être amélioré en adoptant simultanément un sténopé confocal, une perte de signal se produira.
④ Limités par des lasers ultrarapides coûteux, les microscopes à balayage multiphotoniques ont un coût relativement élevé.
