Propriétés optiques des microscopes biologiques
Les performances optiques du microscope sont déterminées par les huit paramètres optiques de base suivants (ou paramètres) :
(1) Ouverture numérique
L'ouverture numérique est également appelée rapport de miroir. Il fait référence au produit de l'indice de réfraction n du milieu entre l'objet observé et la lentille et la valeur sinusoïdale de la moitié de l'angle de la lentille de l'objectif. Utilisez NA ou A. pour représenter. NA=nsin( /2)
L'angle dit de la bouche du miroir fait référence à l'angle entre les rayons marginaux du point observé entrant dans la lentille frontale de l'objectif.
L'ouverture numérique est un paramètre important de la lentille d'objectif et de la lentille de condenseur, et est étroitement liée à d'autres paramètres optiques du microscope. On espère généralement que plus c'est gros, mieux c'est. On peut voir à partir de la formule qu'il existe deux façons d'augmenter l'ouverture numérique, l'une consiste à augmenter l'angle de la bouche du miroir et l'autre consiste à augmenter l'indice de réfraction entre l'objectif et l'échantillon.
Lorsque la première méthode est adoptée, le spécimen et l'objet peuvent être maintenus aussi près que possible. Mais peu importe à quel point, est toujours inférieur à 180 degrés. Ainsi, sin( /2) est également inférieur à 1. L'indice de réfraction de l'air est n=1. Par conséquent, l'ouverture numérique nsin(/2) de l'objectif sec est toujours inférieure à 1, généralement comprise entre 0.04 et 0.95.
Lorsque cette dernière méthode est adoptée, un milieu avec un indice de réfraction plus élevé peut être ajouté entre l'objectif et l'échantillon. Par exemple, l'indice de réfraction de l'huile de cèdre est n=1.515. Lorsque l'huile de cèdre est utilisée comme médium, l'ouverture numérique peut atteindre plus de 1,2. C'est pourquoi, dans certains cas, des lunettes à huile sont utilisées. À l'heure actuelle, l'ouverture numérique maximale que la lentille à huile peut atteindre est de 1,4.
(2) Résolution
La résolution est également appelée taux de discrimination ou pouvoir de résolution. La soi-disant résolution fait référence à la capacité du microscope à distinguer la structure fine de l'objet à inspecter. Elle est inversement proportionnelle à la distance de résolution. La distance de résolution fait référence à la distance minimale entre deux points d'objet pouvant être distingués. Plus la distance de résolution est petite, plus la résolution du microscope est élevée. Si la distance entre deux points d'objet est inférieure à la distance de résolution, les deux points seront confondus avec un seul point et sa structure ne pourra pas être vue clairement. La résolution du microscope est déterminée par l'objectif. Les oculaires ne font que grossir et n'augmentent pas la résolution du microscope.
Dans le cas d'un éclairage central normal, la distance de résolution d de l'objectif est déterminée par la formule suivante.
d=(λ/2)N.A.
Dans la formule : d représente la distance de résolution, l'unité est le micron, λ représente la longueur d'onde de la lumière d'éclairage, l'unité est également le micron.
En lumière visible, la longueur d'onde avec la plus grande luminosité et la plus grande sensibilité pour les yeux humains est {{0}}.55 μm, et la NA maximale de l'objectif est de 1,4. En remplaçant dans la formule ci-dessus, d est d'environ 0.2 μm. C'est-à-dire qu'avec un microscope optique ordinaire, la limite de la distance de résolution est 0.2 μm dans le cas d'un éclairage central. C'est-à-dire que les microscopes optiques ordinaires ne peuvent pas faire la distinction entre deux objets inférieurs à 0,2 μm.
En utilisant la lumière ultraviolette, la longueur d'onde de la lumière d'éclairage peut être réduite, permettant à la distance de résolution d'atteindre 0.1 μm. Mais les rayons ultraviolets ne peuvent pas être vus par l'œil humain. Il ne peut être observé qu'après avoir pris une photo.
La longueur d'onde du flux d'électrons n'est que de 0.00387nm. En utilisant une "lentille électronique" ou une lentille magnétique pour contrôler le flux d'électrons, la distance de résolution du microscope électronique peut atteindre quelques dixièmes de nanomètre. Il peut être utilisé pour observer la structure des atomes.
(3) Grossissement
Le grossissement du microscope est égal au produit du grossissement de l'objectif et du grossissement de l'oculaire. En principe, le grossissement peut être rendu très important. Cependant, si les détails de l'échantillon ne peuvent pas être résolus par l'objectif, quelle que soit la taille du grossissement, cela n'a aucun sens. Théoriquement, on peut en déduire que le grossissement le plus adapté du microscope (appelé grossissement effectif, représenté par M effectivement) est compris entre 500 et 1000 fois l'ouverture numérique de l'objectif. C'est-à-dire 500N.A. Inférieur ou égal à M effectif Inférieur ou égal à 1000N.A.
Dans la plage de grossissement efficace, les yeux peuvent observer longtemps sans fatigue. Si le grossissement est inférieur à 500 NA, il sera difficile à observer. S'il est supérieur à 1000 N.A., cela détériorera la qualité de l'image et provoquera même une image irréelle. Par conséquent, le grossissement supérieur à 1000N.A. est appelé grossissement invalide.
(4) Distance de travail
La distance de travail fait référence à la distance entre la surface inférieure de la lentille d'objectif et la surface supérieure du verre de protection après la mise au point du microscope, en utilisant un verre de protection standard et une longueur de tube mécanique standard. Plus le grossissement de l'objectif est élevé, plus la distance de travail est courte. Généralement, la distance de travail de la lentille d'objectif à faible puissance inférieure à 10 fois est de 5-7 mm, tandis que la distance de travail de la lentille à huile 100 fois n'est que d'environ 0,19 mm.
(5) Profondeur de champ
Lorsque le microscope est focalisé sur un certain plan de l'échantillon, non seulement le plan objet peut être vu clairement, mais également les plans objet supérieur et inférieur qui lui sont connectés peuvent être vus clairement en même temps. La distance entre les plans objet supérieur et inférieur est appelée profondeur de champ, ou profondeur de champ en abrégé.
La profondeur de champ du microscope est très petite et plus l'ouverture numérique est grande, plus le grossissement total est élevé et plus la profondeur de champ est petite. Par exemple, lorsque vous utilisez une lentille à huile avec une NA de 1,25/100 fois et un oculaire de 12,5 fois pour observer, la profondeur de champ n'est que de 0,27 μm. C'est-à-dire qu'après focalisation, seule une fine couche de 0,27 μm d'épaisseur peut être vue clairement à la fois. Les spécimens ordinaires ont généralement plusieurs microns d'épaisseur. Pour voir l'ensemble du spécimen, il est nécessaire d'utiliser le mécanisme de réglage fin du microscope pour observer en couches de haut en bas.
(6) champ de vision
Le champ de vision est aussi appelé champ de vision. Fait référence à la portée de l'objet sous inspection que le microscope peut voir en même temps. Habituellement, nous voulons que le champ de vision soit aussi large que possible. Le champ de vision du microscope est déterminé par le champ de vision de l'objectif et le champ de vision de l'oculaire. Le champ de vision de l'objectif ordinaire est inférieur à 20 mm et le grand peut atteindre plus de 40 mm. Le champ de vision des oculaires 10x ordinaires est de 14 mm et les plus grands peuvent atteindre plus de 24 mm. Une fois l'objectif et l'oculaire conçus, leur champ de vision est fixé. Parce que le champ de vision d'un microscope général est petit, il est impossible de voir l'ensemble du spécimen dans un champ de vision, seul un très petit cercle sur le spécimen peut être vu. De plus, la taille du champ de vision est inversement proportionnelle au grossissement total du microscope. Plus le grossissement total est élevé, plus le champ de vision est petit. La solution est d'utiliser le mover pour faire entrer tour à tour chaque partie de l'échantillon dans le champ de vision et observer tour à tour.
(7) Luminosité du miroir
La luminosité du miroir fait référence à la luminosité et à l'obscurité de l'image de l'objet vue au microscope. Afin de faciliter l'observation, nous souhaitons que l'image résultante soit plus lumineuse. Dans le cas d'une lumière extérieure constante, la luminosité du miroir est proportionnelle au carré de l'ouverture numérique et inversement proportionnelle au carré du grossissement total. Pour rendre l'image plus lumineuse, un objectif à grande ouverture numérique doit être utilisé avec un oculaire à faible grossissement. Par exemple, dans le cas du même objectif, l'utilisation d'un oculaire 5X produira une image miroir 4 fois plus lumineuse que l'utilisation d'un oculaire 10X.
Pour les microscopes utilisant des sources lumineuses électriques, la luminosité de l'image miroir peut être contrôlée en ajustant la luminosité de l'illuminateur.
(8) Clarté
La clarté de l'imagerie au microscope dépend de son système optique, en particulier des performances optiques de l'objectif. Il est lié à la conception, à la fabrication, à l'utilisation et au stockage des microscopes. C'est une question importante et complexe. Du point de vue de l'utilisation et du stockage, les principales raisons qui affectent la clarté sont les suivantes : l'épaisseur du verre de couverture utilisé n'est pas qualifiée, la mise au point n'est pas ajustée à la position idéale, le grossissement total est trop important et la lentille de l'huile l'objectif n'est pas essuyé. Nettoyer, moisissure sur les lentilles, etc.
