Caractéristiques techniques et compétences d'utilisation du microscope à fluorescence à deux photons
La microscopie à fluorescence à deux photons est une nouvelle technologie qui combine la microscopie confocale à balayage laser et la technologie d'excitation à deux photons.
Le principe de base de l'excitation à deux photons est le suivant : dans le cas d'une densité de photons élevée, les molécules fluorescentes peuvent absorber deux photons de grande longueur d'onde en même temps et émettre un photon de plus courte longueur d'onde après une courte période dite de durée de vie de l'état excité. . ; L'effet est le même que l'utilisation d'un photon avec une longueur d'onde la moitié de la longueur d'onde longue pour exciter une molécule fluorescente. L'excitation à deux photons nécessite une densité de photons élevée. Afin de ne pas endommager les cellules, la microscopie à deux photons utilise des lasers pulsés à verrouillage de mode à haute énergie. Le laser émis par ce laser a une énergie de crête élevée et une énergie moyenne faible, sa largeur d'impulsion n'est que de 100 femtosecondes et sa période peut atteindre 80 à 100 mégahertz. Lors de l'utilisation d'une lentille d'objectif à grande ouverture numérique pour focaliser les photons du laser pulsé, la densité de photons au point focal de la lentille d'objectif est la plus élevée, et l'excitation à deux photons ne se produit qu'au point focal de la lentille d'objectif, donc le microscope à deux photons n'a pas besoin d'un trou d'épingle confocal, ce qui améliore l'efficacité de détection de fluorescence. C'est une méthode de recherche importante dans les domaines de la morphologie, de la biologie cellulaire moléculaire, des neurosciences et de la pharmacologie.
1. Le contexte de l'émergence de la microscopie à deux photons - deux limites de la microscopie confocale laser traditionnelle :
1) L'un est le phénomène de phototoxicité : parce que le sténopé confocal doit être suffisamment petit pour obtenir une image haute résolution, et la petite ouverture bloquera une grande partie de la fluorescence émise par l'échantillon, y compris la fluorescence émise par le plan focal, le Oui correspondant, la lumière d'excitation doit être suffisamment forte pour obtenir un rapport signal sur bruit suffisant ; et le laser à haute intensité provoquera une décoloration rapide du colorant fluorescent pendant le balayage continu, et le signal fluorescent deviendra de plus en plus faible au fur et à mesure que le balayage progresse.
2) La phototoxicité est un autre problème. Sous irradiation laser, de nombreuses molécules de colorant fluorescent produiront des cytotoxines telles que l'oxygène singulet ou les radicaux libres, de sorte que le temps de balayage et la densité de puissance optique de la lumière d'excitation doivent être limités dans l'expérience pour maintenir la densité de l'échantillon. actif. Dans la recherche sur les échantillons actifs, notamment les différentes étapes de la croissance et du développement des échantillons actifs, le photoblanchiment et la phototoxicité rendent ces études très limitées.
2. Pourquoi dites-vous que les microscopes à deux photons n'ont généralement pas besoin d'être équipés de lasers à excitation ultraviolette ?
La microscopie à deux photons est une technologie d'excitation de fluorescence basée sur l'effet d'excitation à deux photons : les molécules de colorant fluorescent peuvent être excitées en absorbant deux photons de faible énergie en même temps (l'intervalle de temps entre deux photons atteignant les molécules fluorescentes est inférieur à 1 femtoseconde ), son effet d'excitation peut être équivalent à l'absorption d'un photon de haute énergie de 1/2 longueur d'onde. Par exemple, absorber deux photons aux longueurs d'onde rouges équivaut à une molécule absorbant l'ultraviolet. Les photons de grande longueur d'onde ne sont pas facilement absorbés par les cellules, de sorte que la phototoxicité pour les cellules vivantes est réduite et que le photoblanchiment est également réduit. De cette manière, il joue non seulement la fonction d'excitation ultraviolette, mais évite également les dommages de la lumière ultraviolette à l'échantillon.
3. Quelle est la particularité du laser du microscope à deux photons ?
La probabilité d'absorption à deux photons dépend de la proximité des deux photons incidents dans l'espace et dans le temps (les deux photons doivent arriver en 10-18 secondes). La section efficace d'absorption à deux photons est petite et seuls les fluorophores dans les régions à grand flux de photons sont excités. Par conséquent, la plupart des lasers utilisés sont des lasers au titane saphir, qui peuvent atteindre des vitesses de balayage picoseconde ou femtoseconde, et ont une puissance de crête très élevée et une puissance moyenne faible, de sorte que le photoblanchiment et la phototoxicité peuvent être réduits ou éliminés. Le plus important est de fournir une très grande densité de photons dans une petite plage, ce qui peut assurer l'excitation simultanée de deux photons.
4. Quels sont les avantages de l'excitation à deux photons ?
1) Augmenter la sélectivité du colorant : la plage de lumière d'excitation du laser à système confocal (Ar, Ar/Kr, HeNe) est de 488 nm - 647nm. Cela signifie expérimenter avec des colorants fluorescents excités par les UV, par exemple avec DAPI , Hoescht. La longueur d'onde d'excitation de deux photons est le double de celle d'un photon unique, de sorte que les colorants excités par l'ultraviolet peuvent être excités par la lumière proche infrarouge.
2) Réduire le photoblanchiment : en raison de la réduction du photoblanchiment, le taux de réussite des expériences utilisant CFP/YFP pour le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) augmente.
3) Aucune lentille d'objectif spéciale n'est requise : Du point de vue matériel, l'excitation des colorants excités par les UV avec la longueur d'onde de la lumière proche infrarouge ne nécessite pas de composants optiques UV spéciaux.
4) Améliorer le rapport signal sur bruit : la longueur d'onde de la lumière d'excitation et la longueur d'onde de la lumière émise présentent une grande différence, ce qui améliore le rapport signal sur bruit.
5) Blanchiment localisé au point focal : Puisque l'excitation de fluorescence ne se produit qu'au point focal de l'objectif, il n'y a pas besoin d'un sténopé confocal. Cela améliore la détection de la lumière et le photoblanchiment ne se produit qu'au point focal.
6) Plus facile à pénétrer dans les spécimens : la lumière de longueur d'onde infrarouge n'est pas facilement diffusée par les cellules et peut pénétrer des spécimens plus profonds.
5. Par rapport à la microscopie confocale à balayage laser, quelle est la plus grande amélioration apportée par la microscopie à deux photons ?
1) Photoblanchiment réduit.
2) Phototoxicité réduite.
3) Il n'est pas facile de se disperser et il est plus facile de pénétrer des échantillons épais, tels que des tranches de cerveau.
