Procédure standard pour calibrer les polariseurs dans un microscope polarisant
Le microscope à fluorescence est différent du microscope optique ordinaire en ce sens qu'il n'observe pas d'échantillons sous l'éclairage de sources lumineuses ordinaires. Au lieu de cela, il utilise une certaine longueur d’onde de lumière (généralement la lumière ultraviolette, la lumière bleu-violet) pour exciter les substances fluorescentes à l’intérieur de l’échantillon sous le microscope, les faisant émettre une fluorescence. Par conséquent, le rôle de la source lumineuse dans le microscope à fluorescence n’est pas un éclairage direct, mais celui d’une source d’énergie pour exciter les substances fluorescentes à l’intérieur de l’échantillon. La raison pour laquelle nous pouvons observer des échantillons n'est pas due à l'éclairage de la source lumineuse, mais au phénomène de fluorescence présenté par les substances fluorescentes à l'intérieur de l'échantillon après avoir absorbé l'énergie lumineuse excitée. De là, on peut voir que la caractéristique de la microscopie à fluorescence est principalement que sa source de lumière peut fournir une grande quantité de lumière d'excitation dans une plage de longueurs d'onde spécifique, de sorte que les substances fluorescentes présentes dans l'échantillon puissent obtenir l'intensité de lumière d'excitation nécessaire. Dans le même temps, les microscopes à fluorescence doivent disposer de systèmes de filtres correspondants. Le microscope à fluorescence est un outil fondamental en chimie tissulaire par fluorescence. Il est composé de composants principaux tels qu'une source de lumière ultra-haute tension, un système de filtre (y compris des plaques filtrantes d'excitation et de suppression), un système optique et un système de photographie. Il utilise la lumière d’une certaine longueur d’onde pour exciter l’échantillon et émettre une fluorescence.
1. Méthodes d'excitation par fluorescence : selon la plage de longueurs d'onde de la lumière, il existe deux types : la méthode d'excitation UV (utilisant un éclairage ultraviolet) et la méthode d'excitation BV (utilisant la lumière bleue violette). La méthode d’excitation UV utilise une lumière proche de l’ultraviolet inférieure à 400 nm pour l’excitation. Cette méthode n'a pas de lumière d'excitation visible, de sorte que la fluorescence observée présente la fluorescence inhérente du colorant, ce qui permet de distinguer facilement la fluorescence spécifique de l'échantillon de l'autofluorescence du tissu de fond.
2. Méthode d'excitation BV : elle implique une excitation de l'ultraviolet à la lumière bleue centrée à 404 nm et 434 nm. Cette méthode utilise la lumière bleue pour irradier l'échantillon, de sorte que le filtre de coupure -du système d'observation de fluorescence doit utiliser un filtre capable de bloquer complètement la lumière bleue et de traverser complètement la fluorescence verte et jaune requise. Pigments fluorescents utilisés pour la méthode des anticorps fluorescents. La longueur d'onde d'absorption maximale de la lumière d'excitation et la longueur d'onde maximale d'émission de fluorescence sont relativement proches, de sorte que le filtre utilisé dans la méthode d'excitation BV doit utiliser un filtre à coupe nette. Cette méthode peut utiliser la lumière bleue comme lumière d'excitation, de sorte que l'efficacité d'absorption des pigments fluorescents est élevée et que des images plus lumineuses peuvent être obtenues. L'inconvénient est que la fluorescence inférieure à 500 nm n'est pas visible, tandis que la fluorescence supérieure à 500 nm fait apparaître l'image entière en jaune. Dans la méthode des anticorps fluorescents, la spécificité est principalement déterminée par la couleur propre aux pigments fluorescents. Ainsi, lorsqu’on parle de spécificité subtile, les inconvénients de la méthode d’excitation BV mentionnés ci-dessus ont souvent un impact significatif.
