Quels sont les composants structurels spéciaux d’un microscope fluorescent ?
Le bloc de filtre coloré est un élément important d'un microscope à fluorescence et ses composants principaux sont constitués d'un premier filtre barrière pour la lumière d'excitation, d'un second filtre barrière pour la lumière d'émission et d'un miroir de séparation de faisceau. Les modèles de filtres colorés et les noms des différents fabricants sont souvent incohérents.
1. Filtre de lumière d'excitation et filtre de lumière d'émission : en fonction des caractéristiques de la source de lumière et du pigment fluorescent, les trois types de correspondance suivants sont généralement sélectionnés pour fournir une lumière d'excitation dans une certaine plage de longueurs d'onde et permettre à la fluorescence excitée par l'échantillon de passer à travers et d'atteindre l'oculaire pour l'imagerie.
Excitation UV : le filtre de lumière d'excitation peut laisser passer la lumière UV et bloquer le passage de la lumière visible au-dessus de 400 nm. Le filtre de lumière d'émission correspondant laisse passer la lumière bleue et la lumière dans le champ de vision apparaît en bleu, comme lorsqu'elle est appliquée à une coloration DAPI.
Excitation de la lumière bleue : le filtre de lumière d'excitation peut laisser passer la lumière bleue et bloquer la lumière d'autres longueurs d'onde. Le filtre de lumière d'émission correspondant laisse passer la lumière verte, comme les marqueurs de coloration GFP.
Excitation de la lumière verte : le filtre de lumière d'excitation laisse passer la lumière verte et bloque la lumière des autres longueurs d'onde. Le filtre lumineux d'émission correspondant laisse généralement passer la lumière rouge, comme la coloration à la rhodamine.
2. Filtre de couleur semi-transparent et semi-réfléchissant : sa fonction est d'empêcher complètement le passage de la lumière d'excitation et de la refléter ; Et émettent de la lumière dans la plage de longueurs d'onde correspondante. Son modèle correspond au filtre de lumière d'excitation et au filtre de lumière d'émission.
(2) Objectif et oculaire
Divers objectifs peuvent être utilisés, mais il est préférable de choisir des objectifs avec une échelle supplémentaire et une réduction de l'aberration chromatique, car leur autofluorescence est extrêmement faible et leurs performances de transmission de la lumière (plage de longueurs d'onde) sont adaptées à la fluorescence. Étant donné que la luminosité de fluorescence d'une image dans le champ du microscope est directement proportionnelle au carré du rapport d'ouverture de l'objectif et inversement proportionnelle à son grossissement, afin d'améliorer la luminosité des images de fluorescence, il convient d'utiliser un objectif avec un rapport d'ouverture plus grand. Surtout pour les échantillons présentant une fluorescence insuffisante, un objectif avec un rapport d'ouverture et une transmission lumineuse élevés doit être utilisé, accompagné d'un oculaire avec le grossissement le plus faible possible.
(3) Autres appareils optiques
La couche réfléchissante d'un miroir est généralement recouverte d'aluminium car l'aluminium absorbe moins de lumière ultraviolette et visible dans la région bleu-violet, réfléchissant plus de 90 % (alors que l'argent a une réflectivité de seulement 70 %). Généralement, des miroirs plats sont utilisés. La lentille de focalisation, spécialement conçue et fabriquée pour les microscopes à fluorescence, est en verre de quartz ou en autre verre transmettant la lumière ultraviolette. Le dispositif à lumière tombante, en plus d'avoir la fonction d'une source de lumière transmissive, est plus adapté à l'observation directe d'échantillons opaques et semi-transparents, tels que des plaques épaisses, des membranes filtrantes, des colonies bactériennes, des cultures de tissus et d'autres échantillons. Ces dernières années, de nombreux nouveaux types de microscopes à fluorescence ont été développés en utilisant un dispositif à lumière tombante, connu sous le nom de microscope à fluorescence à lumière tombante.
(4) Source lumineuse
De nos jours, les lampes au mercure à haute pression de 50 ou 100 W sont couramment utilisées comme sources lumineuses. Pendant le fonctionnement, une décharge se produit entre deux électrodes, provoquant l'évaporation du mercure et une augmentation rapide de la pression à l'intérieur de la sphère (ce processus prend généralement environ 5 à 15 minutes). Au cours de ce processus, des quanta de lumière sont émis et la longueur d’onde de la lumière libérée est suffisante pour exciter diverses substances fluorescentes. C’est pourquoi il est largement utilisé dans les microscopes à fluorescence.
La durée de vie des lampes au mercure est relativement courte, généralement 200 heures. En réponse à cette limitation de la durée de vie, ces dernières années, un nouveau type de source de lumière fluorescente X-Cite a été largement utilisé avec une durée de vie d'ampoule très longue de 2 000 heures et une utilisation flexible - aucun préchauffage requis, prêt à l'emploi.
